MMP2、MMP9和VEGF在肾癌中的表达与临床意义论文.docVIP

　　MMP2、MMP9和VEGF在肾癌中的表达与临床意义论文 卜宏民 王连渠 闫拥军 焦志灵 徐国良 【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)与血管内皮生长因子（VEGF）在肾癌组织中的表达与临床分期的意义。方法 蛋白免疫印迹法、ELISA和逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）检测癌组织MMP2、MMP9，蛋白质免疫印迹法和RTPCR检测癌组织VEGF。结果 肾癌组织中MMP2、MMP9和VEGF明显表达，随着病程的进展MMP2、MMP9和VEGF活性逐渐增高，以Ⅳ期晚期最明显，VEGF与MMP2、MMP9表达具有正相关性。结论 MMP2、MMP9和VEGF参与了肾癌临床病情进展和发病机制。 【关键词】 肾癌；基质金属蛋白酶；血管内皮生长因子 基质金属蛋白酶(MMP2和MMP9）及其组织抑制物因子(TIMPs)在恶性肿瘤浸润转移中的作用已成为研究热点〔1，2〕，其中能够水解基底膜主要成分Ⅳ型胶原的MMP2(明胶酶A)、MMP9(明胶酶B)由于参与了细胞外基质(ECM)的降解和血管的发生，被认为在恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要的作用〔2〕。血管内皮生长因子（VEGF）是一种增加血管通透性并促进新血管生长的细胞因子.freelm)；Ⅱ期：肾壁厚＞5 mm，但未侵及纵隔，也无远处转移；Ⅲ期：肾壁厚＞5 mm，侵犯周围组织，也可以有纵隔淋巴结肿大，但无远处转移；Ⅳ期：肾壁厚＞5 mm，不但侵犯周围组织，且有远处转移。 1.2 方法 1.2.1 ELISA MMP2、MMP9和VEGF抗体和酶联免疫吸附法试剂盒购自福建迈新生物科技发展有限公司。液氮罐保存肾癌组织按2.5 ml/g质量加入相当体积的冰生理盐水，用匀浆器将组织研磨，然后在冰浴下超声波粉碎制成匀浆，4℃，10 000 r/min离心10 min，取上清液。实验严格按照MMP2、MMP9和VEGF酶联免疫吸附法说明书步骤进行。 1.2.2 MP2、MMP9、VEGF含量。按10 ml/g的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。10％的十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝脑电泳（SDSPAGE）法上样量为28 μg。电泳条件:4℃。电流20～30 mA。电泳结束后，进行蛋白质转膜。转膜条件：采用孔径为0.22 m的硝酸纤维素膜(NC)，4℃,电流400 mA，转膜3 h。BP(1∶1 000)杂交反应3 h，吐温20/Tris盐酸缓冲液（TTBS）漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)杂交反应1 h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10 min，加入ECL试剂反应5 min，保鲜膜包裹，暗室X光胶片曝光、显影和定影。然后同一张NC膜再与βactin(1∶1 000)进行MP2、MMP9和VEGF PCR引物设计见表1(北京奥科生物科技有限公司)。将PCR扩增的产物5 μl在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压一般为70～80 V。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用Quantity One4.4.0软件行定量分析，以目的基因与βactin条带平均光密度比值表示目的基因mRNA的相对表达量。表1 MMPs和VEGF PCR引物设计 1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件包进行统计学处理，组内不同时相点的比较采用方差分析，组间同一时相点的比较采用t检验，OneRNA MMP2/MMP9和VEGF的表达水平与蛋白质表达水平结果也具有一致性，MMP2/MMP9和VEGF在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肾癌组织中明显表达，尤其Ⅳ期肾癌组织中表达最明显(P＜0.01)。图2和表4。表4 mRNA水平比较MMP2/MMP9和VEGF的表达 3 讨 论 ECM是肿瘤转移的主要屏障。MMPs是降解ECM最重要的酶类。MMPs活性上调与肿瘤侵袭、转移有关。金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs作为MMPs的天然抑制物，可下调MMPs活性，对维持ECM具有重要作用。活化的MMPs与TIMPs的平衡关系受到破坏，提示有肿瘤侵袭和转移的可能性。基质金属蛋白酶是一个依赖锌离子的肽链内切酶基因家族，目前已发现17种，几乎可以降解ECM的所有成分。MMP9也称明胶酶或Ⅳ型胶原酶，分子量为92 kD。MMP9可降解Ⅲ、Ⅳ、V型胶原、明胶等多种底物，而IV型胶原构成基膜的主要支架。因此其在肿瘤发生发展及侵袭过程中起着非常重要的作用。MMPs在肿瘤组织中的表达和分布报道不一。大多数研究认为，明胶酶、间质溶素主要表达于间质细胞，基质溶素(MMP7)是由肿瘤细胞分泌的〔5，6〕，肿瘤细胞和间质细胞可通过多种机制相