p38MAPK基因诱导胶质瘤细胞凋亡论文.docVIP

　　p38MAPK基因诱导胶质瘤细胞凋亡论文 .freela;apoptosis;rats Abstract:AIM To study the effect of p38MAPK transfec-tion on the biological characteristics of glioma cell C6.METHODS p38MAPK a cell C6by lipofectin.Expression of p38MAPK munocytochemistry.HE staining and floetry easure the cell morphology，adhesion and cell cycle.RESULTS p38MAPK a cells，erging.CONCLUSION Apoptosis of glioma cell could be induced by p38MAPK transfection. 0 引言 蛋白质的磷酸化与去磷酸化是传递细胞各种信息的重要转导机制.蛋白激酶催化磷酸基团与蛋白质内特异的氨基酸共价结合.一系列的蛋白激酶及其磷酸化活化构成了信号转导级联反应.丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase.freelinal kinase，JNK）/应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）通路，ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1（big MAP kinase，BMK1）通路和p38MAPK通路.它们参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程，并参与细胞的恶性转化等病理过程.p38MAPK除在细胞应激、炎症反应中具有重要作用外，也与细胞的发育、分化和凋亡密切相关.胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，p38MAPK对其生长的调节作用尚不了解.我们将外源性p38MAPK基因转染大鼠胶质瘤细胞系C6，以期研究其对胶质瘤细胞生物学特性的影响，为充实信号转导在胶质瘤中的作用提供理论依据. 1 材料和方法 1.1 材料 大鼠胶质瘤细胞系C6由本教研室保存.pCMV5-p38MAPK质粒和兔抗鼠p38MAPK抗体由新加坡国立大学林圣彩教授惠赠.pCMV5质粒由本校生化教研室孙强惠赠.脂质体购自Gibco公司.免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司. 1.2 基因转染 大鼠胶质瘤细胞系C6在含150mL L-1 小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养，细胞生长至对数期时以2×105 /孔接种于6孔板，培养24h.将2μg pCMV5-p38MAPK，10μL脂质体分别溶于100μL无血清培养基，两溶液缓慢混匀，室温放置30min，加入0.8mL无血清培养基，混匀后加入上述培养细胞内，常规培养4h后，加入1mL含150mL L-1 小牛血清的培养液，继续培养24h.同法转染pCMV5质粒及未转染C6细胞作为对照. 1.3 形态学检测 转染同时制备细胞爬片，转染后30h取出，PBS洗涤2次，950mL L-1 乙醇固定15min，HE染色. 1.4 免疫细胞化学染色 细胞爬片处理同上.一抗为兔抗鼠p38MAPK抗体（1∶50），4℃过夜，加入二抗，室温30min，加入SABC复合物，DAB显色，苏木素衬染. 1.5 细胞周期分析 3组细胞各约1×10 6 个，经胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤2次，700mL L-1 冷乙醇固定过夜，用DPAI进行染色，于流式细胞仪进行细胞周期分析. 2 结果 2.1 形态学检测 转染pCMV5-p38MAPK质粒后，细胞由原来的多突起形逐渐变为双极或圆形，体积缩小，细胞内空泡增多（Fig1），贴壁性降低，36h后可见部分细胞漂浮于培养液中.pCMV5质粒组和空白对照组无明显变化.HE染色显示pCMV5质粒组和空白对照组细胞形态一致，可见大量核分裂象，转染pCMV5-p38MAPK质粒组核分裂象明显减少，细胞形态改变，密度减低，部分细胞固缩变圆，深染，胞核染色质边集，呈环状、碎块状或新月体状，可见胞质“出泡”现象，此即凋亡细胞（Fig2）. 2.2 免疫细胞化学染色 转染pCMV5-p38MAPK质粒组P38MAPK蛋白表达阳性，主要定位于胞质或（和）胞核，凋亡细胞阳性稍强，部分凋亡细胞胞核也可见阳性表达（Fig3）.pCMV5质粒组和空白对照组均未见p38MAPK蛋白表达.证实转染pCMV5-p38MAPK质粒组有外源性p38MAPK基因的表达，而pCMV5质粒组和空白对照组则无外源性p38MAPK基因. 2.3 细胞周期分析 转染pCMV5-p38MAPK质粒组、pCMV5质粒组和