p38丝裂原活化蛋白激酶在大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的磷酸化及其意义论文.docVIP

　　p38丝裂原活化蛋白激酶在大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的磷酸化及其意义论文 【摘要】 目的： 观探讨大鼠视网膜缺血再灌注损伤后p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化及其意义. 方法： 采用升高眼内压的方法，制作实验性视网膜缺血再灌注大鼠模型. 将30只APK及磷酸化p38 MAPK （pp38 MAPK）蛋白的表达变化. 结果： p38 MAPK在缺血再灌注组各时间点的视网膜组织内的表达保持相对恒定，与正常对照组相比无统计学上的变化（P 0.05）. pp38 MAPK的表达水平在缺血再灌注组12 h时即有明显升高，24 h时达到高峰.freeliareperfusion injury）损伤主要发生在视网膜动静脉阻塞、未成熟的视网膜病变、糖尿病性视网膜病变等视网膜血管阻塞所致的缺血性疾病中，它们均可造成不同程度的视网膜缺血. 在缺血再通后，视网膜反而受到更为严重的损伤，造成视功能下降［1- 2］. 因此，加强对视网膜缺血再灌注损伤机制的研究是非常重要的. 目前视网膜缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，本实验通过建立大鼠的视网膜缺血再灌注损伤模型，观察丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）家族成员之一的p38 MAPK蛋白在缺血再灌视网膜中的表达以及其磷酸化的时相变化，探索p38 MAPK在视网膜缺血再灌注损伤中的可能作用，为临床治疗视网膜缺血再灌注损伤类疾病提供理论依据. 1材料和方法 1.1材料成年健康APK及小鼠抗磷酸化p38 MAPK (pp38 MAPK)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；山羊抗βactin多克隆抗体购自美国Chemicon公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或山羊二抗购自Chemicon公司；ECL化学发光试剂盒、PVDF膜购及Hyperfilm胶片自美国Amersham公司；蛋白质提取及浓度测定试剂盒购于美国BioRad公司. 1.2方法 1.2.1视网膜缺血再灌注模型的建立动物随机分成两组：正常对照组（6只）和缺血再灌注组（24只）. 缺血再灌注组又分为再灌注后2, 12, 24, 72 h等4个时间段（每时间段6只大鼠）. 以前房灌注升高眼压的方法制备大鼠视网膜缺血. 再灌注损伤模型，具体方法为： 大鼠以水合氯醛麻醉(400 mg/kg)，将生理盐水瓶连接输液器，升高输液瓶至于大鼠眼垂直距离为150 cm左右处，灌注压力达到110 mm Hg (14.63 kPa). 将连接输液器的7号头皮针自大鼠颞侧角膜缘穿刺入前房，手术显微镜直视下可见灌注压平衡后，视网膜苍白水肿，表明视网膜中央动脉供血已被完全阻断. 60 min后降低液瓶高度至27 cm以下( 20 mm Hg)，此时可见视网膜变红，表明视网膜血管重新开放，已形成再灌注. 此时拔出前房灌注针头，再灌注计时开始. 1.2.2视网膜内p38MAPK和pp38MAPKA的检测① 视网膜组织蛋白质的提取：正常对照组动物及再灌注后第2, 12, 24, 72 h的动物以水合氯醛麻醉，快速取双侧眼球，分离出视网膜，液氮中速冻. 加入裂解缓冲液（0.15 mol/L NaCl, 0.05 mol/L Tris, 0.1 mg/L SDS，0.1 mg/L苯甲磺酰氟，1 μg/L抑蛋白酶肽，1 mg/L NP40）. 匀浆，冰上裂解30 min，4℃ 12000 g离心20 min，吸上清，-70℃保存. ② 蛋白质SDSPAGE及电转印：用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，取20 μg蛋白，进行125 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳结束后，用BioRad半干电转移装置将蛋白质转印至PVDF膜，用含50 mg/L脱脂奶粉的PBST溶液（0.2 mmol/L PBS，0.02 g/L吐温20）封闭，室温2 h. ③ APK（1∶2000）， pp38 MAPK（1∶2500）和βactin（1∶5000）抗体，室温过夜. PBST洗膜，10 min×3次，再加入HRP结合的羊抗小鼠IgG（1∶5000）或驴抗山羊IgG（1∶5000），室温孵育2 h. PBST洗膜后，加入ECL显色剂，置暗室曝光. 曝光后的胶片进行显影、定影，用UVP凝胶成像系统对胶片上的条带进行扫描分析. 统计学处理：用Labin）的缺血后其功能并无变化，但是在再灌注后却出现明显的功能障碍，甚至出现不可逆的损伤，这就是视网膜的缺血再灌注损伤. 大量的研究表明，视网膜缺血再灌注损伤的发病机制较为复杂，是多种因素综合作用的结果，如氧自由基的损伤、微血管的损伤、白细胞的作用和钙超载等，但是有关的分子机制尚不清楚［3］. MAPK在许多生长因子、细胞因子和受体激活