p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响论文.docVIP

　　p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响论文 【摘要】 目的观察p53和血管内皮生成抑素基因(AS)共转染对HL60细胞生长和血管内皮生长因子(VEGF)、bax、bcl2表达水平的影响,探讨联合基因治疗急性白血病的可能性。方法选用脂质体将p53+AS转染HL60细胞,以RTPCR法检测转染后细胞目的基因的表达。通过细胞集落形成实验、MTT试验及流式细胞仪观察p53+AS转染后对HL60细胞生长的影响。采用RTPCR及免疫组织化学检测p53+AS转染后HL60细胞的VEGF、bcl2与bax表达的改变。结果p53+AS转染成功并在HL60细胞中稳定表达,明显抑制细胞的生长,协同促进凋亡,使细胞的VEGF和bcl2表达下降,bax表达升高。结论p53+AS转染对HL60细胞生长具有明显的抑制作用,两者存在协同效应,其机制可能是影响bcl2/bax。 【关键词】 基因； p53; 血管抑制素类; 白血病; HL60细胞; 细胞凋亡 基因疗法是近年来肿瘤治疗的热点,但效果不理想。原因之一是肿瘤的发生、发展是一个复杂的过程,涉及到多基因的异常以及各种其他因素的作用,单一基因治疗只能作用于肿瘤发生、发展过程中的某一个环节,只有相关的基因共同作用才能更为有效地抑制肿瘤。p53基因是重要的抑癌基因。野生型p53蛋白对细胞周期有重要调控作用,.freeline 2000(美国Invitrogen公司);质粒抽提试剂盒(Qiagen Plasmid Midi,德国Qiagen公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI 1640(美国Gibco公司)。RTPCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)逆转录试剂(美国Promega公司);免疫组织化学试剂(武汉博士德生物工程有限公司)。 1.2方法 1.2.1细胞转染培养大肠杆菌E.coli GT116(质粒载体)扩增质粒,按质粒抽提试剂盒说明书操作;设空载体组、p53组、AS组和p53+AS组,分别取pVITRO2、pVITRO2p53、pVITRO2Angio和pVITRO2p53Angio质粒各2 μg,与Lipofectamine 2000 5 μL混匀,静置20 min,加入HL60培养板进行转染;加入200 μg/mL潮霉素筛选,抗性细胞继续培养扩增。 1.2.2细胞集落形成实验取对数生长期细胞以每孔150 0.5 mL1的密度接种于24孔培养板,培养2~3周,肉眼可见集落后加Giemsa应用液200 μL染色20 min,流水洗去染液,干燥后计算细胞集落数。 1.2.3绘制细胞生长曲线取对数生长期的4种细胞按每孔1 000的密度接种于96孔板上,分别于接种后24,48,72 h，前4 h加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,37 ℃孵育4 h,常温下500 r/min离心,用酶标仪测定D(490 nm)值,以D(490 nm)为纵坐标,以时间为横坐标绘制生长曲线。 1.2.4检测细胞周期收集各组细胞(密度为1×106 mL-1)送流式细胞仪检测,分析细胞周期。 1.2.5RTPCR p53: 5’CAGCCAAGTCTGTGACTTGCCGTAC 3’CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC 94 ℃ 3 min(94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s)×30 Ang:5’GAACTACAGAGGGACGATGTCCTC 3’CAGAAGATGGTGGAGGTGTTG 94 ℃ 3 min(94 ℃ 20 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 20 s)×35为引物,进行RNA提取和逆转录,行PCR扩增,取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察结果并拍照。 1.2.6VEGF、bcl2和bax免疫组织化学检测细胞经PBS冲洗、晾干后,加入DAB显色试剂盒中各1滴,经苏木精对比染色,盐酸返蓝,封固,按试剂盒说明书操作。VEGF、bcl2和bax均以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。 1.3统计学处理测定值以x±s表示,SPSS 10.0统计软件分析,多组间均数比较用单因素方差分析,组间两两比较用最小显著法。 2结果 2.1细胞转染RTPCR电泳显示,p53、AS在HL60细胞中共转染成功并稳定表达，在355 bp左右出现两条特异性条带,分别为p53、AS的扩增片段(图1)。 M:Marker; AS:血管内皮生成抑素基因 图1p53、AS在HL60细胞转染后RTPCR电泳 Fig 1p53 and AS transfection and expression in HL60 cell 2.2细胞集落形成p53、AS和p53+A