p53基因在翼状胬肉组织中表达的研究论文.docVIP

　　p53基因在翼状胬肉组织中表达的研究论文 何文林，王利华，陈容森，高阳 【摘要】 目的 通过观察p53基因在翼状胬肉组织中的表达，探讨翼状胬肉的发病与凋亡机制之间的关系。方法 选择25例翼状胬肉组织作为实验组，对照组选用正常眼鼻侧结膜组织，制作石蜡切片后常规HE染色和p53单克隆抗体免疫组化染色，实验数据进行秩和检验。结果 实验组中的p53蛋白含量显著高于对照组.freelm，组织大小约3～4mm。取材后即置入10%的甲醛溶液浸泡固定，常规脱水、石蜡包埋。 1.2 石蜡切片的制作 从10%甲醛溶液中取出组织，流水冲洗过夜，依次采用乙醇梯度脱水，70%乙醇15s，80%、90%、95%、100%乙醇各3h，二甲苯透明3次，每次10min，从低熔点石蜡到高熔点石蜡浸蜡，共3次，每次1h。包埋，4μm连续切片，每个石蜡块切4～5张。 1.3 HE染色 将组织切片依次放入二甲苯脱蜡和95%乙醇各2次，每次1min；蒸馏水冲洗2次，每次5min；苏木精染色液浸染10min；流水冲洗5min；0.5%伊红乙醇浸染2min；95%乙醇和无水乙醇脱水各2次，每次2min；滴中性树脂，加盖玻片，光镜下观察翼状胬肉组织的病理学改变。 1.4 免疫组化染色 切片脱蜡至水化，橼酸微波抗原修复15min，3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS浸泡3×5min，加入即用型鼠抗人p53单克隆抗体，4℃过夜，PBS冲洗3×5min，滴加生物素标记的二抗，室温孵育30min，PBS冲洗3×5min，每张切片滴加约50μl抗生物素-过氧化酶溶液，室温30min。PBS冲洗3×3min。滴加新鲜配制的DAB溶液显色3～10min。用自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。以PBS替代一抗作为阴性对照。阳性对照片由福州迈新公司提供。 1.5 结果判断标准 以细胞浆内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，每张切片在高倍显微镜下(200倍)随机选择5个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。根据阳性细胞数占上皮细胞的比例判断结果：0～5%为阴性 （-），5%～25%为弱阳性（+），25%～50%为中等阳性（++），＞50%为强阳性（+++）。 1.6 统计学处理 采用SPSS 11.0软件，将实验组与对照组的实验数据进行秩和检验。 2 结果 2.1 HE染色 2.1.1 正常结膜的组织学表现 结膜分为上皮层和基质层。上皮层由3～5层细胞组成，表层为扁平细胞，中层为多边形细胞，基底层为立方形或柱形细胞。基质层为疏松结缔组织，其间有散在的毛细血管，少量成纤维细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。 2.1.2 翼状胬肉组织的病理学表现 胬肉组织上皮层均可见不同程度的增生。上皮下组织可见成纤维细胞增生活跃、新生血管增多，在血管周围有大量炎性细胞浸润，有淋巴细胞、浆细胞和少量的中性粒细胞。 2.2 免疫组化染色 在翼状胬肉中，p53蛋白染色阳性细胞主要位于上皮细胞基底层。p53基因蛋白产物阳性反应呈棕黄色颗粒，在细胞核呈阳性表达。p53蛋白在两组中的表达见表1，翼状胬肉中的p53蛋白含量较正常结膜高，两者差异具有高度显著性(P 0.01)。表1 p53蛋白在翼状胬肉和正常结膜样本中的表达（略） 3 讨论 翼状胬肉是一种组织增生性疾病，以新生的纤维血管组织自球结膜生长向角膜表面侵袭为其特点。目前，关于翼状胬肉的病因和发病机制仍未明确。翼状胬肉的临床表现为新生的组织不断生长、增厚，并逐渐侵入角膜，手术切除后易复发，治疗效果不甚理想［3］。此特点与肿瘤组织相似，肿瘤发生发展的重要原因是细胞异常增殖和凋亡失衡。翼状胬肉的发病可能代表着细胞增生和凋亡的异常。 目前，已发现的凋亡相关基因多达数十种，根据其功能的不同可分为三类：抑制凋亡基因，如Bcl-2、EIB等；促进凋亡基因，如p53、Bax、Fas等，双向调控基因；如c-myc、Bclx等。 p53 基因参与细胞DNA的修复与合成，调节细胞的分化、凋亡，控制细胞的周期，是引起人类肿瘤发生最常见的突变基因。翼状胬肉的发生、发展与许多环境因素相关，如紫外线刺激、慢性充血和炎症等。其中，紫外线是最重要的环境致病因素，户外工作者(接受紫外线辐射较多) 的p53蛋白表达较户内工作者明显增多，提示紫外线可能引起p53蛋白的异常表达［4］。 p53作为抑癌基因，主要的生物学作用是调控细胞周期和诱导细胞凋亡，维持基因组和细胞稳定，抑制肿瘤生长。p53基因定位于17P13.1，长度约20kb，由11个外显子和10个内含子组成，人p53蛋白由393个氨基酸组成，分子量为53×103。p53分为野生型和突变型，野生型为肿瘤抑制基因，可抑制在培养过程中有其他癌基