siRNA特异性抑制骨肉瘤细胞株HER2基因的表达论文.docVIP

　　siRNA特异性抑制骨肉瘤细胞株HER2基因的表达论文 王玉峰，王岩峰，祝勇，邴佩旭 【摘要】 ［目的］观察RNA干扰技术对骨肉瘤细胞株（OS732细胞）HER2（表皮生长因子受体2）表达的抑制效应。［方法］体外化学合成HER2序列特异性双链RNA（siRNA），转染入OS732骨肉瘤细胞株中，分别用RTPCR、TT（四甲基偶氮唑盐比色法）检测细胞的增殖和化疗敏感性，观察细胞生物学特性的改变。［结果］HER2 siRNA对OS732细胞HER2 mRNA表达明显抑制.freelically synthesized double stranded RNA（dsRNA）formulated ine 2000.The HER2 gene expression inhibition munocytochemistry.The chemosensitivity of transfected cells to cisplatin ined by MTT measurement.［Result］Sequence specific siRNAs targeting HER2 door lines in vitro greatly reduced the expression of the HER2 mRNA,effects lasted for 10 days,On the 9th day of interference,HER2 protein expression odalities in the treatment of human osteosara. Key RNA等外源基因的侵害，高效特异的阻断基因的表达是RNAi的一大特征，对该技术的研究已成为肿瘤治疗的重要方向〔1〕。癌基因产物HER2是表皮细胞生长因子受体（EGFR）家族中的重要成员。HER2在人类恶性肿瘤中的高表达，被证明与肿瘤的侵袭性相关，抑制该受体功能是肿瘤治疗的重要方向。本文通过采用RNAi技术抑制人骨肉瘤细胞HER2的表达，从而为骨肉瘤的基因治疗提供新策略。 1 材料和方法 1.1 材 料 人骨肉瘤OS732细胞株购自北京积水潭医院骨科研究所，HER2单抗购自北京中山公司，Reverse transcription system，Trizol，dNTP购自大连宝生公司，Taq DNA聚合酶购自Takara公司。HER2引物序列为：F5′CCTGCTGAACTGG TGTATGCA 3′，R5′ TCAGAGTAATCATCAAATTG 3′，由Takara公司合成，预扩增片断产物为429 bp。以βactin作内对照，引物序列为；F5′ GATTGCCTCAGGACATTTCTG3′，R5′ GATTGCTCAGGACATTTCTG 3′；扩增产物长为690 bp。 1.2 方 法 1.2.1 siRNA合成 根据HER2基因在GenBank中的序列设计相应的siRNA：从启动子下游75碱基处找到第1个AA二聚体，记录AA下游19个碱基序列为目的序列，计算目的序列中嘌呤和嘧啶的含量百分比（G／C）〔2〕。应用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的惟一性。人工合成针对26442664nt位碱基靶序列的2条寡核苷酸链。siRNA F5′CUGGUGUAUGCAGAUUGCCUU3′，siRNA R5′GGCAAUCUGCAUAC ACCAGUU3′。序列非特异性siRNA：siRNA F5′CUUGUAUGGGCAAUGCUU3′，siRNA R5′-GGCAAUCUGCCCAUACAAGUU3′。 1.2.2 细胞培养及转染 骨肉瘤细胞分组：A组为空白对照（未转染）；B组转染非特异性的siRNA；C组转染特异性的siRNA。转染前24 h，取对数生长期的细胞胰酶消化，计数，调整细胞浓度为1×105／ml，接种，孵箱培养36 h，待细胞培养达80％融合。转染：（1）配制液体，A液：7.5 μl siRNA+250 μl McCoy5A培养基；B液，10 μl Lipofectamine+250 μl McCoy5A培养基，吹匀，室温5 min。（2）A液与B液混合，吹匀，室温放置20 min。（3）将混合液加入6孔培养板中培养6 h，对照组只加10 μl Lipofectamine+250 μl McCoy5A培养基。（4）6 h后，换液，置培养基中培养48 h。 1.2.3 RTPCR法检测HER2 mRNA 首先进行培养细胞总RNA抽提，取5 μl RNA水溶液在琼脂糖凝胶电泳上检测RNA质量，用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，-70℃保存。取2 μl总RNA，