siRNAMed19对人肺癌A549细胞Med19转录、表达的影响论文.docVIP

　　siRNAMed19对人肺癌A549细胞Med19转录、表达的影响论文 李金东 孙梅 高楠 罗树生 王荣有 金成彦 张兴义 【摘要】 目的 研究siRNAMed19对人肺癌A549细胞Med19的影响。方法 利用前期已合成的siRNAMed19慢病毒载体，感染A549细胞，并以无病毒感染组作为空白对照组，以慢病毒载体感染组作为阴性对照组。采用荧光图片和白光图片对比方法判断细胞的感染率；RTPCR法检测细胞Med19mRNA的转录水平； ed19蛋白表达水平。结果 慢病毒载体对人肺癌A549细胞的感染率在80%以上，siRNAMed19慢病毒感染组Med19mRNA转录水平明显降低，敲减效率大于70%，Med19蛋白表达量也明显降低。结论 siRNAMed19慢病毒载体可以高效感染人肺癌A549细胞，siRNAMed19对A549细胞Med19的转录和表达具有明显的抑制和消减作用。 【关键词】 siRNA；Med19；肺癌；A549细胞 肺癌的治疗效果近年仍不理想.freelersham公司，抗羊Med19购自Abcam公司，抗鼠IgG购自Santa Cruz公司， PCR用试剂、引物购自上海吉凯基因技术有限公司，胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司，Trizol购自Invitrogen, dNTP、MMLV逆转录酶、Rnase抑制剂购自Promega公司，oligo dT购自上海生工， A549细胞购自中科院细胞库，pcDNA3.1(-)Med19siRNAGFP、pcDNA3.1(-)Med19NCGFP慢病毒载体均来自本实验室, 滴度为4×108 TU/ml。 1.2 肿瘤细胞培养及传代 从液氮罐中取出人肺癌A549细胞，常规方法复苏，重悬细胞，接种至培养皿中，晃匀后置37℃、5%CO2培养箱培养。次日更换1次培养液。将生长90%汇合的细胞进行传代，连续传代20次后获得相对纯净的肿瘤细胞用于实验。 1.3 慢病毒载体感染人肺癌A549细胞 取对数生长期的A549细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液接种于6孔板中的3个孔，每孔细胞数约5×104。空白对照组不加入任何病毒，阴性对照组加入pcDNA3.1(-)MedNCGFP慢病毒，siRNAMed19慢病毒感染组加入pcDNA3.1(-)Med19RNAiGFP慢病毒。感染3 d后观察慢病毒报告基因——绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，用荧光显微镜观察有荧光细胞的数量来判断感染率。感染率大于50%者继续培养，待感染时间达到5 d后收集细胞抽提RNA进行RTPCR检测。 1.4 RTPCR检测 常规法提取总RNA，紫外分析测定RNA浓度，经逆转录获得cDNA，置于-80℃保存备用。Med19(222 kb)和βactin(214 bp)上、下游引物分别为：βactin上游5′TCGTGCGTGACATTAAGGAG3′,下游5′AAGGTAGTTTCGTGGATGCC3′和Med19上游5′GTAACTTCCTGCCTGACCTG3′,下游5′TGTGCTTGTGCTTATTCTTCTTC3′。采用标准曲线分析法（2-ΔΔCt分析法）分析每一标本的Med19mRNA的表达水平。 1.5 ed19，TBST洗膜3次，每次10 min。用封闭液1∶6 000稀释抗鼠IgG，室温下孵育PVDF膜2 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ed19siRNAGFP和 Med19NCGFP慢病毒载体对A549细胞的感染 见图1。空白对照组未见荧光，阴性对照组及敲除组细胞荧光感染效率大于80%。 图1 三组细胞荧光观察结果（略） 2.2 RTPCR方法检测siRNAMed19对A549细胞Med19基因转录的影响 siRNA慢病毒感染组Med19mRNA 表达水平（0.178±0.042）较空白对照组（0.617±0.089）及阴性对照组（1.002±0.075）明显减少（P＜0.05），熔解曲线：actin和Med19的扩增产物溶解曲线，没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。 2.3 siRNAMed19对A549细胞Med19蛋白表达的影响 siRNAMed19慢病毒感染组中Med19蛋白的表达明显减弱，光密度分析与空白对照组及阴性对照组明显减弱，各组内参GAPDH表达量无显著差异(图2)。 图2 ed19对A549细胞生长周期的影响 流式细胞仪分析结果显示，实验组与其他两照组相比较，在正常二倍体细胞的G0G1期前出现的一个亚二倍峰即为凋亡峰，提示siRNAMed19转染人肺癌A549细胞后，可诱导癌细胞周期停止在G1期，抑制肺