增强氯化血红素催化活性用于水胺硫磷比色检测探究.docVIP

增强氯化血红素催化活性用于水胺硫磷比色检测探究 　　摘要建立了一种基于增强氯化血红素（Hemin）过氧化物酶催化活性比色检测水胺硫磷的方法。在H2O2存在下，Hemin催化氧化底物3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB），使其失去1个电子，导致反应体系由无色变为蓝绿色。水胺硫磷的加入可提高Hemin对底物亲和力，进一步增强其催化活性，使底物氧化失去2个电子，反应体系由蓝绿色变为黄色，且颜色变化程度与水胺硫磷浓度成正比。在最优条件下，本方法的动态检测范围为2～100μg/L，检出限为1.2μg/L（3σ）。其它有机磷农药对水胺硫磷检测无明显干扰，实际样品中水胺硫磷的加标回收率为93.0%～113.0%。本方法可应用于农产品中水胺硫磷残留的检测 关键词氯化血红素；水胺硫磷；过氧化物酶；有机磷农药 1引言 水胺硫磷作为一种高毒有机磷农药，在蔬菜种植等方面仍被经常非法使用，引发一系列安全问题[1]。目前，有机磷农药检测的方法有色谱法[2]，酶抑制法[3]，免疫学[4，5]方法等。色谱法分析时间长且需要昂贵仪器和专业操作人员；酶抑制法等灵敏度相对较差，且易产生假阳/阴性现象。近年来，荧光法[6，7]、纳米材料如纳米金[8]、二氧化铈[9]、磁性四氧化三铁[10]、氧化石墨烯[11]、分子印迹技术[12]、离子迁移率谱仪预富集进样技术[13]等被广泛用于有机磷农药的检测，但这些技能易受外部环境的干扰。因此需要开发更可靠，便捷的有机磷农药检测方法 氯化血红素（Hemin）作为辣根过氧化物酶（HRP）的辅基，对HRP的催化活性至关重要。HRP化学本质是蛋白质，在应用过程中易受到外界环境的影响，成本较高，且反应条件比较严格[14]。相对于HRP，Hemin的获取成本较低、易储存、不易变性，且在生物降解中更加稳定。近年来，研究者采用少量Hemin与G四联体构建类辣根过氧化物酶生物传感器，并成功用于赭曲霉毒素A[15]、癌症标志物[16]、蛋白质[17]等的检测。本研究组也发现高浓度的Hemin本身也具有过氧化物酶的活性，且核酸适配体对Hemin催化活性有一定抑制作用，在此基础上建立了基于Hemin催化活性比色检测As的方法[18]。迄今为止，利用Hemin进行有机磷农药的比色检测还鲜有报道。本研究建立了基于增强Hemin催化活性进行比色检测水胺硫磷的方法，考察了Hemin的酶促反应动力学，发现水胺硫磷的加入会进一步提高Hemin对底物3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB）的亲和力，增强其催化活性，加快了底物TMB的氧化速度，使得反应体系颜色发生显著变化，从而实现水胺硫磷的比色检测。本方法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性好且裸眼可辨等优点，可应用于农产品中水胺硫磷残留的检测 2实验部分 2.1仪器与试剂 吸收光谱用全波长读数仪（ThermoScientificMultiskanGOMicroplateSpectrophotomer，USA）记录 Hemin（美国SigmaAldrich公司）；NaH2PO4、TMB、H2O2（30%）、水胺硫磷及其它有机磷的竞争性农药（阿拉丁股份有限公司（上海））；其它试剂均为市售分析纯试剂。实验所用水均为三次蒸馏水 2.2水胺硫磷检测 将3.5μL2mmol/LHemin溶液与不同浓度的水胺硫磷标准液（总体积≤5μL）充分混匀后，30℃孵育30min，然后加入一定体积20mmol/LNaH2PO4溶液（pH3.0），最后加入10μL2mol/LH2O2和10μL5mmol/LTMB混合液，补加蒸馏水至500μL，充分混匀，检测其吸收光谱并计算ΔA（450nm），其中ΔA=A（水胺硫磷，450nm）-A（空白，450nm）。在空白对照实验中，用5μL水替代不同浓度的水胺硫磷溶液 2.3??际样品分析 分别对两个不同地点的废水和西红柿汁等样品进行检测。废水分别从贵州大学附近的河流和农田采集，并分别命名为废水1和废水2，用0.22μm膜过滤，待测。西红柿购自当地市场，先榨成汁，并在1000r/min条件下离心20min，上清液用0.22μm膜过滤，待测[19]。在实际样品中，分别加入2和10mg/L水胺硫磷标准溶液，测定回收率 3结果与讨论 3.1实验原理 前期研究发现，当TMB被催化氧化后，其二苯胺基上的N原子会失去一个电子，使得TMB分子带一个正电荷，此时溶液的颜色为蓝色。当Hemin与底物的浓度比增加后，则反应体系的催化活性会进一步增强，导致所有TMB分子中的2个N原子均失去电子，此时溶液的颜色为黄色[18]。图1展示了本方法检测水胺硫磷的基本过程。在H2O2存在下，Hemin催化氧化底物TMB，使其失去1个电子，导致反应体系由无色