感受态制作注意事项.docVIP

A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4的培养菌，最好从-80甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 首要问题就是操作是防止污染，因为这个是最容易影响感受态制作的因素。 其次，就是悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮，如果用移液器，把枪头前面剪掉一部分，然后再吹，这样吹的比较柔和感受态制备及转化的方法很多，效率最高的是电转化，可达到10次方，普通的化学转化只能达到8次方，一般自己做也就是6-7次方 ，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管即开始转化，但效率也最低，只能满足环形质粒的转化（某些公司也有现成试剂盒）。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。? ?? ?以下是一些制备感受态的注意事项：? ?? ?1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。? ?? ?2、培养基的装量。培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。? ?? ?3、培养基的pH值。这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。? ?? ?4、培养后的OD值。其实这是一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，感受态绝对数量要大一点。因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。? ?? ?5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。? ?? ?6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。? ?? ?7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。? ?? ?8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。? ?? ?9、有报道说感受态制备之后放置24h效率会更好。? ?? ?10、冻存的感受态用一次拿一管，不要反复冻融。化冻之后立即使用，不要冰上放太久。? ?? ?11、操作时可以轻弹轻甩，尽量避免用移液器吹吸。我是做微生物环境科学方面的,感受态和转化会常做,有几点感受想和大家分享一下:1.做感受态之前,DH-5a的板子最好活化一下,如果板子放的时间长,感受态不好.2.CaCl2要提前遇冷.3.做好的感受态在4度放24-48h,转化效率会更高.4.热激时间要精确.5.自己做的感受态斑长得大,长得快;买的感受态长得时间需要稍长一些,但不要超过20个小时.6.转化前要检测一下模板的量,我们平时做时就是跑个胶,和Marker的亮度比一下,大概估计一个值,再做转化.像我们建文库,DNA割胶纯化之后检测,如果能看见条带一般建文库都能成功.