壁虎醇提物对人食管癌细胞EC9706增殖及凋亡蛋白表达的影响论文.docVIP

　　壁虎醇提物对人食管癌细胞EC9706增殖及凋亡蛋白表达的影响论文 王晓兰 王建刚 宋佳玉 李瑞芳 【摘要】 目的研究壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞株EC9706的生长抑制作用及其机制。方法通过MTT法检测不同浓度、不同时间壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞的生长抑制作用;倒置显微镜观察不同浓度壁虎醇提物作用细胞24 h后细胞形态的改变;吉姆萨染色后光学显微镜下观察细胞凋亡的形态改变; SP免疫组化法检测细胞内凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果6～8 mg/ml壁虎醇提物作用于细胞24，48，72 h后能够明显抑制EC9706食管鳞癌细胞株的生长(P 0.01,与阴性对照比较)，抑制率分别为13%～76%, 37%～88%, 54%～93%,抑制作用呈剂量和时间依赖性;Geimsa染色可见凋亡细胞;免疫组化结果显示,壁虎醇提物(6,7 mg/ml)处理细胞24 h后，与阴性对照组比较，细胞内Bcl-2蛋白无明显变化，而Bax蛋白表达升高，Bax/Bcl-2比值升高。结论壁虎醇提物能够抑制EC9706细胞的增殖并诱导其凋亡.freela公司);RPMI-1640干粉(Gibco公司);MTT粉剂(Sigma公司);二甲基亚砜(天津市化学制剂厂);鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、鼠抗人Bax单克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(购自福州迈新生物技术公司)。 1.4 仪器二氧化碳培养箱(日本SANYO公司);倒置显微镜XSZ-D2型(重庆光学仪器厂) ;超净工作台SP-DJ-2B型(浙江省金沄市荣华仪器制造有限公司);ZS-板式酶标仪(中科院生物物理所制造);86-3型超声仪(上海超声波仪器厂);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司);冷冻干燥仪(德国MARTIN CHRIST公司);96、6孔培养板为美国Costar公司产品。 2 方法 2.1 药物提取及配制 2.1.1 壁虎醇提物的提取取干壁虎1 000 g粉碎，加入一定体积预冷的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)浸泡过夜后超声30 min，超低温离心机离心(8 500 r/min,20 min)，取上清，加入无水乙醇使其终浓度为55%, 4℃放置并搅拌(每30分钟搅拌1次)，4 h后离心(8 500 r/min, 20 min)，取上清，真空旋转蒸发(55℃)回收乙醇，浓缩液冷冻干燥得到壁虎醇提物，-20℃保存待用。以上操作均4℃条件下进行。 2.1.2 药物配制将壁虎醇提物以RPMI1640完全培养液配置8 mg/ml母液，0.22 μm微孔滤膜过滤,母液稀释得7.5，7，6.5，6，5.5 mg/ml供实验用,以上药物均实验前新鲜配用。 2.2 MTT法6测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用EC9706细胞株生长于含10%胎牛血清的1640完全培养液中,.freell接种于96孔培养板，每孔100 μl，实验分3组，即实验组、阴性对照组、阳性对照组，每组设5个复孔并设空白调零孔。将接种EC9706细胞的培养板置于37℃,5% CO2,95% 湿度的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，弃去原有的培养液,实验组分别加入各200 μl的6种不同浓度壁虎醇提物,阴性对照组加200 μl培养液,阳性对照孔组加终浓度为20 μg/ml丝裂霉素C 200 μl,混匀后置于培养箱中分别培养24,48,72 h后取出培养板，每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml的 MTT,继续培养4 h终止培养, 吸去孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μl,置 37℃摇床中10 min ,使结晶物充分溶解后在酶联检测仪于490 nm波长处测定各孔光密度值(OD值),并按下式计算抑制食管癌细胞的百分率。 抑制率(%) =(阴性对照组平均OD值 - 实验组平均OD值) / 阴性对照组平均OD值 ×100% 2.3 细胞形态学观察96孔板细胞接种方法同MTT法，分别加入5.5，6，6.5，7，7.5，8 mg/ml浓度壁虎醇提物作用24 h后，取出96孔板在倒置显微镜观察每孔细胞形态改变，拍照。细胞爬片后，按常规方法用吉姆萨染色，于光学显微镜镜下观察细胞凋亡形态学改变。 2.4 S-P法检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液后，以1×105个/ml的细胞浓度接种于内含有盖玻片的6孔培养板中，24 h细胞贴壁后换用新鲜培养液，实验设对照组和药物组，实验组加入6，7 mg/ml壁虎醇提物2 ml，阳性组加入2 ml丝裂霉素C,使其终浓度为20 μg/ml,阴性对照组加入同体积的RPMI 1640培养液，24 h后取出6孔板，细胞爬片用PBS浸洗，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS浸洗;0.3% Trixon-100通透液通透30 min