慢病毒介导的Sema3A基因转染对心肌细胞凋亡的影响.pdfVIP

我们想知道，对于心肌细胞，Sema3A 是否有诱导凋亡的作用，是否因为机体通 过改变 NGF 和 Sema3A 分泌平衡，减少心梗后心肌细胞凋亡，导致后继神经分布 的异常？目前关于 Sema3A 与心肌的研究很少，且均为动物实验，尚没有细胞实 验对心肌中 Sema3A 的表达及作用进行研究。由于动物实验受神经体液等因素影 响较大，细胞模型可以简化条件，更加明显的体现某一因素改变的影响。我们使 用原代培养的乳鼠心肌细胞，通过缺氧干预，模拟急性心梗过程中的细胞损伤， 建立了心肌细胞缺氧模型。在这一实验中，我们通过Western Blot和Real time PCR ,检测到培养的心肌细胞中存在Sema3A，接着，对心肌细胞进行不同时间的 缺氧处理，检测到随着缺氧时间的延长，Sema3A 的表达水平逐渐下降。为了研 究Sema3A对心肌细胞的作用，设计构建了过表达和抑制Sema3A表达的慢病毒。 发现过表达 Sema3A 慢病毒转染，可直接诱导心肌细胞凋亡，而抑制心肌细胞 Sema3A的表达，可降低缺氧心肌细胞的凋亡。 4 第一部分 缺氧损伤对心肌细胞 Sema3A 表达的影响 信号素3A( Sema3A)是信号素家族的重要成员，其功能复杂涉及神经排斥， 33 5 细胞迁移，分化以及诱导凋亡等诸多方面 。温华知等人 的动物实验证明，心 梗后大鼠心脏梗死周边区发生电重构，梗死周边区Sema3A明显减少，Sema3A的 受体明显增加。如前言所述，心脏中 Sema3A 与 NGF 分布平衡的改变，可能是导 致心梗后室性心律失常发生的重要原因。至于其为什么改变，Sema3A 对于心肌 细胞有没有直接作用，目前还没有实验进行研究。然而，这一研究是非常必要的。 只有弄清楚 Sema3A 在心梗后发挥的生理功能，才能进一步研究其分布改变带来 的病理性影响，如神经分布的改变，从而为今后心梗后心律失常的治疗打下基础。 为了进行这一研究，首先需要建立一个合适的模型。考虑到体内实验会受到神经 体液因素的多种干扰，为了尽量减少不必要因素的干扰，我们设计了使用原代培 养的乳鼠心肌细胞进行研究的体外实验。实验中，使用厌氧盒对心肌细胞进行干 预，模拟心梗时发生的损伤，研究缺氧损伤后心肌细胞Sema3A表达的改变。 材料与方法 1 材料： 实 验 动 物 : 购 自 复 旦 大 学 医 学 院 实 验 动 物 科 学 部 ( 许 可 证 号:SYXK(沪)2007-0002)， 1日龄的Sprague–Dawley大鼠，雌雄不限。 2.仪器和试剂(表 1) 大型仪器 中型仪器 试剂及耗材 CO2 细胞培养箱 相差显微镜(Leica) DMEM 低糖培养液(GIBCO公司) 培养 (德国 Heraeus 公司) 优质胎牛血清(GIBCO 公司) 0.25%trypsin(GIBCO 公司) 实时荧光定量 PCR 仪 微量紫外分光光度仪 焦碳酸二乙酯处理水(上海生工) (美国 Perkin-Elmer PCR Light Cycler 3.0 公司) 分析纯异丙醇、氯仿、无水乙醇