Candidarugosalipase的表现及特性分析.pptVIP

Candida rugosa lipase的表現及特性分析PDB ID:1CRL 林柏宏 11月26日 Introduction 脂肪酶的生化特性 A、催化之反應 酯解反應(Ester Hydrolysis) 酯化反應(Ester Synthesis) 內酯化作用(Intererterification) B、水解催化的特異性 非特異性脂肪酶(non-specific lipase) 1,3-特異性的脂肪酶(1,3-specific lipase) 2-特異性脂肪酶(2-specific lipase) 醯基特異性脂肪酶(Acyl group specific lipase reaction) C、催化機制 醯化反應(acylation) 去醯化反應(deacylation) 脂肪酶的結構特性 α/β水解酵素摺疊構形(α/β hydrolase folding) 催化三元体(catalytic triad) 為S209，H449，E341 含氧陰離子洞(Oxyanion hole) 為G124，A210 頂蓋(Lid domain) 位置62~92AA 1CRL (A)Closed (inactive) form，黑色部分為胺基酸的位置62 ~ 92所形成的頂蓋(Lid domain)。(B)Open (active) form，黑色部分為胺基酸的位置62 ~ 92所形成的頂蓋(Lid domain)。 We can analyze 可以改變lid domain對受質的特異性以及活性有顯著的影響 。 將LIP的tunel部分的胺基酸突變後，以不同的triacylglycerides來觀測基質特異性的差異。 LIP的序列以基因重組的方法，產生新式脂肪酶跟原本比較之間的差異，看看是否能提高熱穩定性和活性。 各個脂肪酶胺基酸序列相同度的比較。 結晶結構發現脂肪中的頂蓋部位(lid domain)胺基酸序列差異頗大，因此以LIP4(19)/lid1，lid2，lid3與lid5分別轉型入P. pastoris系統，並將得到的脂肪進行酵素動 力學以及活性測試，結果發現改變lid部位對脂肪的受質特異性以及活性都有顯著的影響。如在置換為lid2時，對triolein的活性可增至wild type的5倍，而置換為lid5時，則為 wild type的2倍。但在lid1及lid3中則無明顯增加。同時在esterase活性中，只有lid2的活性提升，lid1，lid3及lid5的活性皆下降，由此證明lid部位對C.rugosa脂肪的功能，具有顯著的影響。 CRL的Lid兩種結構~open為紫色 closed為藍色 有於Lid domain有hydrophobic moment 而又以LIP4最高，所以Lid在LIP的interfacial activation過程扮演重要角色 所以置換不同的Lid會呈現不同的物理性質，如蛋白質的表面的淨電荷和疏水性 從模擬結構中可以看到活化能高低以及鄰近區的靜電力作用力，會決定該LIP的活化速率 可以看到Lid以帶正電的Lys75與蛋白質表面帶負電的Asp292形成氫鍵及靜電力。 此作用使Lid維持打開的狀態，進而穩定open的結構 而Lid2上帶電荷殘基分布與Lid4相似。 所以酵素動力學特性跟Lip4相近。 以下置換Lid1、Lid3、Lid5由於帶電荷殘基的分佈情形與Lid4不同。 可以看到Lys75與Asp292的靜電引力受到Glu71的干擾，因此呈現較差的催化的效率。 以上的電腦分析的結果，發現了幾各與LIP活化過程相關的重要胺基酸。 所以可以提供以後做site-directed mutagenesis的實驗，可以進ㄧ步了解LIP的結構與功能間的關係。 * * Candida rugosa所產生的五種菌体外脂肪酶(LIP-1~LIP-5)，皆為534個胺基酸，且在序列上具有高度的相似性，但卻有不同的基質特異性，由此可知CRL的序列與結構及基質特異性的相關性可能是非常嚴謹的。 α-helix (red) and β-sheet (yellow) Lid (green)、氧陰離子洞(orange)、催化三元体(purple) (A) (B) 相似的程度 Lid Lip 1的Lid *