第09章 疏水层析.pptx

第二部分 分离技术;第9章 疏水层析 Hydrophobic Interaction Chromatography ;9.1、概述; 非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性(Hydrophobicity)。 非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应(Hydrophobic effect) 。 ;疏水作用(hydrophobic interaction): 非极性分子进入水中，有聚集在一起形成最小疏水面积的趋势，保持这些非极性分子聚集在一起的作用则称为疏水作用。; 对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的热动力学折衷的结果。; 就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。 虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏水区域，这部分暴露在外疏水性基团称为疏水补丁。;高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。;亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理 靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)； 令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露出掩藏于分子内的疏水性残基； 高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用。 ; 一般在lmol／L (NH4)2SO4 或 2mol／L NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起。 然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附。 ;也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用 高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。（相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来，疏水作用强的物质随后被洗下来） 对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。 ; 疏水层析介质由基质和配体(疏水性基团)两部分构成。 基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。 ; HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基 。 ;;;常用商品化疏水层析介质;⒊ Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h配基结合量为每ml 40 μmol苯基Phenyl，疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，;一、层析柱的制备 1、层析介质选择 配基的性质与密度对决定疏水相互作用层析介质最终的选择性、结合能力起到重要的作用。 ; 配基的种类和目的蛋白的性质在确定疏水相互作用层析的选择性方面是高度显著的参数。最合适的配基必须通过用目的蛋白进行筛选试验来确定。;;2、层析柱的选择 柱床高度通常为5～15cm。 对一个优化好的分离方案进行规模放大时，可保持柱高不变，增加柱的直径 粗柱子（内径为1.6 ～ 5.0cm）适合进行HIC层析。;3、装柱 将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose Cl-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间； 采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物； 并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中； 尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。 ;二、盐的选择;;;图22 不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱：细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、α-糜蛋白酶原。;;图23 起始溶液中的盐浓度影响选择性和分辨率。;对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致关重要。最经常使用磷酸缓冲液。 pH 的选择必须和蛋白稳定性和活力兼容。 然而，在疏水相互作用层析过程中，pH5-8.5对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小。 pH的增加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。;;四、层析步骤;34;Sample application;Washing out unbound material;Elution;Elution;加样;;;大多数条件下，增高温度会增强疏水