紫外分光光度法测饮料中咖啡因浓度.ppt

《食品科学》（Journal of Food Science）最近发布的研究说，健康成年人每天摄入的咖啡因含量最多不要超过400毫克（相当于4杯咖啡左右）。 适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏 可以有效抗威胁我们身体健康的自由基，而自由基是造成许多疾病的主因。 实验方法 一、 咖啡因标准曲线的绘制 精确称取咖啡因标准样品0.0500g于100mL的容量瓶中,用三氯甲烷溶解后定容得浓度为500mg/L的储备液。实验前用三氯甲烷稀释,配成0.5, 2,5, 10, 15, 20, 30mg/L的系列标准溶液。(氯仿的极性很弱作萃取剂）。以三氯甲烷作空白,测定其在278nm处的吸光度值。 二、样品前处理 取少量可乐饮料用超声清洗器在常温下超声脱气l--2min,用100μg/L的微量进样器准确量取100μL超声脱气后的可乐饮料至5mL的离心试管中,加入2mL三氯甲烷,放入离心机,在2500r/min下离心3min,用5mL注射器吸取下层清液（有机层）进行紫外光谱分析. 三、样品测定 样品前处理方法处理市售的娃哈哈无咖啡因儿童可乐饮料来制备参比溶液,并以此为空白在278nm处测定经同样方法处理过的样品溶液中咖啡因的吸光度值,重复三次, 取平均值。通过标准曲线计算其含量。 （或者以三氯甲烷作参比液，测定其紫外吸收。） 分析条件的优化 1、溶剂的选择 2、样品和体积的混合体积比选择 溶剂的选择 准确移取三份1. 0 mL 200 mg / L 咖啡因水溶液于三支10 mL 比色管中, 分别加入二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯8. 0 mL, 充分震荡, 萃取后离心分离, 取清液在250~ 300 nm 波长范围内扫描. 比较咖啡因在不同溶剂中的紫外吸收光谱, 可以看出三氯甲烷作溶剂时, 吸光度最大, 最大吸收峰位于276 nm. 由此可知三氯甲烷的萃取效率最佳.. 咖啡因紫外吸收图谱 有关咖啡因萃取常用溶剂的常用性质 1、咖啡因在氯仿中的分配比最高,在三氯乙烯中的最小.因此,在通常的咖啡因萃取过程中研究者们较多采用氯仿为溶剂来获得较高的萃取效率。 2、部分溶剂如乙酸乙酯与水之间有一定的相溶性,因此,在饮料中的咖啡因萃取过程中,若取少量的饮料与萃取溶剂进行混合时,饮料中的水及其它各组分和溶剂就会形成一个混容体系而不会出现分层现象。 3、水在三氯甲烷中的溶解度很小,萃取过程后可直接取下层氯仿萃取液进行仪器分析而不需要其它的处理过程如干燥等。 4、根据萃取理论,萃取效率E=1-(l+Kφ)-n,其中K为分配比,φ为相比,n为萃取次数,本实验φ为20,K为15,n为1,则 E=0.9967,即一次萃取效率可达99.67%,单步萃取效率高. 选用溶剂为2mL,样品用量分别选100,200和400μL即相比分别为20,10和5进行测定,样品体积为400μL时,所得咖啡因含量相对略偏低,而样品体积为100μL和200μL时结果基本一致,为了取样方便(100μL微量进样器取样),本实验取样体积为100μL,即相比为20. 标准曲线 观察咖啡因的标准曲线可知随着咖啡因含量的增加,其在最大吸收波长处的吸光度也逐渐增加, 呈现较好的线性关系。线性方程为: Y=0.0491X+0.001 相关系数R2=0.9999 实验结果 高效液相色谱分析 实验试剂及设备： ①Waters 1525-2996系统 ②Hypersil ODS2 5um色谱柱 ③Millipore 纯水过滤器 ④4.5um F型过滤膜 ⑤甲醇HPLC级标准品:含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg?mL-1等5份对照品溶液 ⑥试样：市售可乐 色谱条件： ①流动相：等度为60:40（甲醇：水） ②检测波长：254 ③进样量：5μL ④运行时间：6min ⑤积分：自动积分 实验步骤 (1)将配制好的流动相于超声波清洗器上脱气15min； (2)系统除气泡、大流速泵抽、装柱子、小流速装柱； (3)平衡：流速由小至大，配比缓慢增加至压力恒定； (4)精密配制含咖啡因浓度为约1mg?mL-1的咖啡因甲醇溶液。将 此甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg?mL-1等5份对照溶液； (5)根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析； (6)依次分别吸取5μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数 据； (7)将可乐试样稀释一倍，经超声波脱气后，精密吸取5μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据； (8)实验完成后，按要求关好仪器。 标准曲线绘制