第六章植物细胞制药.pptVIP

植物是自然界中最好的化工厂 目前超过100，000种化合物被从植物中鉴定，并以每年约4，000种新化合物的速度增加 植物次生代谢物质大多具有生物活性，被用作医药品、化妆品、食品添加剂等 植物次生代谢物的获得 直接从野生植株中分离提取 植物细胞培养 缺点：植物细胞生长缓慢；次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化 优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域限制；不占用耕地 植物发根培养 内容纲要 什么是发根？ 发根培养的特点、优点 发展历史 发根农杆菌的生物学特性及致病机理 发根的诱导及培养 研究现状、存在问题、解决办法 什么是发根？ 发根（hairy root）是发根农杆菌 （Agrobacterium rhizogenes)感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，其Ri质粒上的T—DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型（形成多分枝的、生长迅速的不定根） 发根培养的特点、优点 稳定性和生长迅速的特点是工业化生产梦寐以求的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的 很多次生代谢产物仅在特定的器官或组织中形成，即只有分化才伴随次生代谢过程的进行，发根中含有相应的次生代谢物含量明显比培养的细胞高 近三分之一传统药材的药用部位是根，发根培养系统在传统药材生产中具有更重要的意义 发展历史 1934年，Hildebrand报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根，自此开始对其致病机理进行研究，并与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）一起作为基因工程的载体 80年代后期，发根培养技术应用在植物次生代谢物生产上 发根农杆菌的生物学特性 发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） ：土壤细菌，能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物 Ri质粒（root inducing plasmid）：T－DNA区、Vir区两个功能区 T－DNA区插入到寄主植物基因组中，表达决定发根生长和冠瘿碱合成的基因，冠瘿碱的检测是评价植物转化是否成功的证据之一 Vir区不插入寄主植物基因组DNA中，但与T－DNA的转移有关，其缺失或突变不能使感染的植物出现发根 Ri质粒感染过程 发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特殊的小分子化合物，诱导Ri质粒的Vir区基因群活化； 在Vir区基因表达产生的酶作用下T－DNA被切下； 3. T－DNA转移进细胞并整合到植物基因组DNA中； 4. T－DNA在细胞中转译，使宿主植物产生发根 发根的诱导及培养 发根的筛选及增殖培养 含抗生素的培养基上继代培养除菌 选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养 增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根的生长 一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙子发根每月增殖2500～5000倍） 发根的鉴定 形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝， 多根毛，无向地性 组织水平：GUS活性的测定或NPTII酶的检测 细胞水平：冠瘿碱的测定 分子水平：Southern Blot方法 影响发根农杆菌转化的因素 菌株 常用菌株：LBA9402，ATCC15834，R1601，TR105，A41027，A42659 植物及外植体 对Ri质粒的敏感性：双子叶植物单子叶植物，草本植物木本植物 在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子叶柄、胚轴作为外植体 将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根诱导率的变化 理化因子的影响 水溶性酚 ：乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚 ，激活Vir区基因表达 光照 其它 感染前高渗处理、诱导培养时添加生长素等 影响发根培养及次生代谢物合成的因素 培养基 基本培养基、碳源、氮源 植物激素 发根能在无激素培养基上较好生长，但外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合成均有影响 pH值 前体 诱导子 刺激代谢物的产生和分泌 影响发根培养及次生代谢物合成的因素 培养方法 固体培养 液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养 两步培养法 两相培养法 反复成批培养 补料成批培养 生物反应器 发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要 通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器 研究现状 人参（Panax ginseng）：在无外源激素的条件下，发根生长速度为用激素诱导根，人参皂甙含量最高可达干重的0.95％ 长春花（Catharanthus roseus）：从发根中检测到细胞培养中一直未能得到的长春碱和长春新碱 亲本植株能合成的次生代谢物都可用发根培养生产