荧光实时定量PCR-1.pptVIP

相对定量 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 相对定量内参 稳定表达于不同类型的细胞和组织,而且其表达量是近似的,无显著性差别; 其稳定的表达水平与目标基因相似; 不受任何内源性或外源性因素的影响,如不受任何实验处理措施的影响 GAPDH，b-Actin，18S 相对定量 对目的基因和内参基因同时做PCR 待测样品目的基因的浓度 待测样品内参基因的浓度 . 对照样品目的基因的浓度 对照样品内参基因的浓度 目的基因处理前后变化= 双标准曲线法 对目的基因和内参基因做两组标准曲线 待测样品目的基因的浓度 待测样品内参基因的浓度 . 对照样品目的基因的浓度 对照样品内参基因的浓度 目的基因处理前后变化= 检测样品 内参基因H 目的基因X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 6391.5 343.4 0.0537 1.000 待测样品1 8589.7 17.3 0.0020 0.037 待测样品2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874 相对定量的算法 2 -△ △ Ct – 假设 100% efficiency – 一个内参基因 Pfaffl法 – 扩增效率 – 一个内参基因 Vandesompele 法 – 扩增效率 – 多个内参基因均一化 2 -△ △ CT 假设目的和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过5％  样品 目的基因(mean Ct) 内参基因(means Ct) △ Ct △ △Ct 2 -△ △ Ct 处理前 18 17 1 0 1 处理后 16 17.4 -1.4 -2.4 5.3 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 荧光实时定量PCR reporter: 魏雯帆 实验目的 基本概念 结果分析 4 1 2 3 实验流程 实验目的 1 实时定量PCR的广泛应用 病原体测定 肿瘤基因检测 免疫分析 基因表达 突变及其多态性 基因表达 由于荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。 基本概念 2 PCR 链式反应的雪崩效应 实时荧光定量PCR PCR扩增反应中，引入一种荧光化学物质， 对每一个循环产物荧光信号的实时检测 可以得到荧光扩增曲线 实现对起始模板定量和定性分析 典型荧光PCR的四个阶段：扩增曲线 Base 荧光物质 激发光 发射光 滤光片 检测（观察） 两种定量化学 染料染色 SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料 与DNA双链结合时发光 游离时不发光 PCR过程中染料的掺入：信号强度与双链DNA分子数正比 PCR过程结束，可控制温度缓慢升高 (ie. 60oc to 95oc, 0.2oc/sec) dsDNA解链成为ssDNA SYBR Green I被释放，荧光信号消失 Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性 熔解曲线 原始图谱 熔解曲线 将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) 原始图谱 对数图谱 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 熔解曲线 染料的特点 3 实验流程 1. RNA提取 TRIZOL法 2. 反转录成cDNA 3. 对cDNA的纯度及量度用actin引物跑胶分析。 4. 设计Real-time PCR引物，引物一般需跨内含子，在cDNA中长度为100-200bp. 5. 以a