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分生讨论 Western Blot 蛋白质双向电泳 临五1505 应佳霏2201150512 杨丽洁2201150513 1 Western Blot 1 定义 是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。 Western Blot 利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法 Southern印迹法 对RNA的印迹分析 Northern印迹法 1 原理 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 1 流程 1 蛋白质样品制备 1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子，也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和SDS结合后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。 1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶成分 纯净水 丙烯酰胺 N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS Tris-甘氨酸溶液 四甲基乙二胺(TEMED) 过硫酸铵(APS) 1 转膜 原理： 蛋白因结合SDS而带电荷，转膜即在电场作用下从胶中转至膜上的过程。 1 转膜 半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白 湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD的蛋白 1 封闭 为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭。 常用的封闭液： 脱脂奶粉（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液 ） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 封闭条件： 4°C摇动，封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。 1 一抗、二抗杂交 ●把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与滤膜温育，室温小时或4℃过夜。 ●倒掉一抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 ●加入配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 室温一小时或4℃过夜。 ●倒掉二抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 不同二抗稀释浓度的效果图 1 底物显色 显色方法 代表类型 特点 酶促底物发光法 DAB显色法 稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般，成像性较差，药品疑有一定致癌性。 化学发光法 （推荐使用） ECL发光法 稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重复标记， 1 底物显色 1 应用 1.Western blot法诊断囊虫病 2.应用荧光定量PCR 和Western- blot 检测RNA干 扰肺腺癌A549 细胞STAT3基因表达水平 3.Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原 2 蛋白质双向电泳 双向电泳的实验原理 ◆第一向：等电聚焦 ◆第二向：SDS—PAGE电泳 双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）是等电聚焦电泳和SDS的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 第一向：等电聚焦原理（IEF） 在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。 蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征。 这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。 同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。 PI(等电点） 第二向：SDS—PAGE电泳原理 聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。（与琼脂糖凝胶电泳相似）在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。且SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。 双向电泳实验流程 样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG