转基因生物细胞反应器.pdfVIP

1896 1920 1987 2006 第四篇 生物制品生产 第9讲 转基因生物反应器 第2节 转基因细胞生物反应器 一 转基因方法 （1）电穿孔法 利用脉冲电场提高 细胞膜的通透性， 在细胞膜上形成纳 米级的微孔，达到 增加通透性的效果 ，从而使外源DNA 转移至细胞中。 简单、效率较高。 （2）脂质体载体包埋法 将需转移的外源DNA或RNA 与脂质体混合，带负电的 DNA自动结合到带正电的 脂质体内形成DNA-阳离子 脂质体复合物。由于脂质 体具有磷脂双层结构，与 细胞膜类似，因此可以与 受体细胞膜融合，从而将 外源DNA转入宿主细胞。 效率高。 （3）逆转录病毒法 逆转录病毒是一种整合型 的单链RNA病毒。 将目的基因重组到反转录 病毒载体上，感染细胞。 病毒进入细胞后，利用宿 主细胞的酶体系自行转录 和复制，从而可以使病毒 单拷贝基因组稳定地进入 宿主细胞。 载体容量小（8KB）。 二 宿主细胞及筛选 在体外能无限生长的细胞作为受体细胞。采用特 异性选择标记用于快速有效地筛选转染细胞。例 如： 胸腺嘧啶核苷激酶 (Thymidine kinase,TK)： 当 转入TK-细胞时，其基因产物可使宿主细胞获得 对HAT培养液的抗性。 二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase,DHFR)：缺失DHFR的CHO细胞不能合成 四氢叶酸，只能在添加胸苷、甘氨酸和嘌呤的培 养液上生长。转染dhfr基因的缺陷型CHO细胞可 在不含胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养液中生长。 三 蛋白高效表达策略 氨甲喋呤（Mtx）是动 物细胞关键代谢酶二 氢叶酸还原酶（DHFR ）的抑制剂，细胞经 过氨甲蝶呤处理后存 活下来的细胞中dhfr 基因得以扩增，提高 二氢叶酸还原酶的表 达水平，抵消氨甲蝶 呤的抑制作用，与该 基因相邻的染色体片 段同样扩增。 例子：tPA 第一个哺乳动物细胞表达 生产的医用蛋白是溶血栓 药物组织型纤维酶原激活 剂 （Tissue plasminogen activator，tPA）。 将人的tPA cDNA克隆在含 有强启动子和终止子的表 - 达载体上，转染dhfr 细胞 ，用氨甲蝶呤处理培养， tPA随着dhfr基因大量扩增 ，新筛选出的转化株进行 大规模培养高水平生产人 的重组tPA。 四 动物细胞反应器生产药用蛋白应用举例 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达制备促 红细胞生成素 （erythropoietin,EPO） 红细胞生成素EPO 红细胞生成素（erythropoietin ,EPO） 人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一 种激素样物质，为分子量6～7万的糖蛋白。 药用价值：能够促进红细胞生成。服用红细胞生成 素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增 加血液中红细胞百分比）。 兴奋剂 促红细胞生长素（ＥＰＯ）属于基因兴奋剂，可 以增加人体内的红细胞数量，从而使肌肉获得更 好的氧供，增强运动员的耐力。 但是长期使用可使人体血液粘稠，增加心脏负担， 导致血液凝固、血栓等心血管疾病，甚至死亡。 在2005年2月份的 《神经科学》杂志上，西班牙 医生公布了一个病例，一位职业自行车运动员在 经常使用含有EPO的药物之后发生脑血管栓塞。 例子1 生产EPO的CHO工程细胞 电激法 脂质体法 宿主细胞： CHO：中国仓鼠卵巢分离的细胞