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ICS67.060 x20 QC 中华人民共和国行业标准 QC/T XXXXX—XXXX 大豆食品中异黄酮含量的测定 Determination of soybean isoflavone in soyfoods 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 发布 前言 本标准附录A为资料性附录。 本标准由中国食品工业协会豆制品专业委员会提出。 本标准由中国食品工业协会豆制品专业委员会归口。 本标准起草单位： 本标准主要起草人： 大豆食品中异黄酮含量的测定 范围 本标准适用于大豆食品中异黄酮含量的测定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 术语和定义 大豆异黄酮 （Soybean Isoflavones） 大豆中以异黄酮葡萄糖苷和相应苷元形式存在的物质，包括3种游离型异黄酮苷元（Aglycon）和9种结合型糖苷（Glycosides）。分子式如下：大豆苷元（C15H10O4）、染料木素（C15H10O5）、黄豆黄素（C16H12O5）、大豆苷（C12H20O9）、染料木苷（C21H20O13）、黄豆黄苷（C22H22O10）、丙二酰基大豆苷（C18H12O7）丙二酰基染料木苷（C24H22O13）、丙二酰基黄豆黄苷（C25H24O13）、乙酰基大豆苷（C17H12O5）、乙酰基染料木苷（C23H22O5）、乙酰基黄豆黄苷（C27H26O14）。 方法提要 样品制备、提取、分离后，经高效液相色谱分析，依据保留时间峰面积进行定性和定量。 试剂和材料 本标准使用符合 GB/T 6682 规定的一级水。除另有规定仅使用分析纯试剂。 大豆异黄酮单体标准储备溶液配制。使用精度0.0001 g 分析天平分别精确称取12种大豆异黄酮标准品 1 mg 置于储液瓶中，向其中加入 200 μL二甲基亚砜 (DMSO)，400 μL 乙腈，400 μL 80% 的甲醇溶液（DMSO：乙腈：甲醇 = 1:2:2），充分溶解标准品，配制成 1 mg/mL 的原始溶液。室温下存放不超过6个月。 大豆异黄酮标准溶液配制：取 50 μL 标准品原液置于冻存管中，加入 450 μL 80% 的甲醇溶液后混合均匀，配制成 100 μg/mL 单标标准溶液。 大豆异黄酮混合标准品标准溶液的配制：等量吸取各标准品原液混合，加80% 的甲醇溶液配制成 100 μg/mL 混合标准溶液原液，并逐步稀释配制成 1、 5、10、20、30、40、60 μg/mL 不同浓度梯度溶液以制作标准曲线。工作标准溶液室温下存放不超过6个月。 甲醇（色谱分析级） 乙腈（色谱分析级） 二甲基亚砜（DMSO-分析级） 乙酸 仪器和设备 色谱系统：二元梯度泵系统，紫外检测器，数据采集系统。 分析天平：精度 0.0001 g。 移液器：量程 1 - 5 mL。 旋转蒸发仪：维持35℃ 并振动。 摇床：300 r/min。 滤膜：孔径0.22 μm。 离心机：6000 r/min。 微量离心管：15 mL，一次性。 分析步骤 样品处理 取适量样品冷冻干燥并制成粉末。 准确称取（1.00 g ± 0.01 g）的各样品粉末，置于15 mL 离心管中，向其中加入5 mL 乙腈、5 mL 超纯水，密封后充分混匀，在室温条件下，使用摇床以300 r/min 的速度振荡提取 2 h。然后以 6000 r/min 的速度，在室温下离心 20 min，上清液通过慢速定量滤纸进行过滤。滤液通过旋转蒸发仪在 35℃ 条件下蒸发至干，向其中加入 5 mL 80% 的甲醇溶液以溶解干物质，通过 0.22 μm 的有机系过滤器过滤处理过后的样品溶液，除去不溶物。在 -20℃ 条件下冷冻保存备用，并尽快分析。 色谱条件 色谱柱 C18柱 (5μm、4.6 mm * 250 mm)。 流动相： 流动相A：含有 0.1% 乙酸的超纯水溶液。 流动相B：含有 0.1% 乙酸的乙腈溶液。 柱温：35 ℃。 进样量：20 μL。 检测波长：262 nm。 流速：1.2 mL/min。 洗脱梯度、流速、及运行时间 测定 测试样品用乙腈 - 水提取液（1:1），在室温条件下提取2小时，将提取液进行过滤、旋转蒸发并重旋，去除提取液中妨碍检测的杂质，并通过高效液相色谱分析测定（HPLC）。大豆异黄酮糖苷和苷元在 C18 反相柱上以乙腈 – 水为流动相分离，在紫外线262 nm 处测定。结果以各异黄酮单体的含量表示。 定性 分别将大豆异黄酮单标标准溶液（5.2）按色谱条件（7.2）进行高效液相色谱测定，依据单一标准