透射电子显微镜样品制备技术preparationofspecimensfor.PDF

透射电子显微镜样品制备技术 preparation of specimens for transmission electron microscopy 图片： toushe dianzi xianweijing yangpin zhibei jishu 透射电子显微镜样品制备技术(卷名：生物学) preparation of specimens for transmission electron microscopy 基本要求是：①尽可能保持材料的结构和某些化学成分生活时的状态；②材料的厚度一 般不宜超过 1000 埃。组织和细胞，必须制成薄切片以获得较好的分辨率和足够的反差；③ 采用各种手段，如电子染色、投影、负染色等来提高生物样品散射电子的能力，以获得反差 较好的图像。 样品制备的方法随生物材料的类型以及研究目的而各有不同。对生物组织和细胞等，一 般多用超薄切片技术，将大尺寸材料制成适当大小的超薄切片，并且利用电子染色、细胞化 学、免疫标记及放射自显影等方法显示各种超微结构、各种化学物质的部位及其变化。对生 物大分子（蛋白质、核酸）、细菌、病毒和分离的细胞器等颗粒材料，常用投影、负染色等 技术以提高反差，显示颗粒的形态和微细结构。此外还有以冷冻固定为基础的冷冻断裂── 冰冻蚀刻、冷冻置换、冷冻干燥等技术。 超薄切片术 将小块生物材料，用液态树脂单体浸透和包埋，并固化成塑料块，后用 超薄切片机切成厚度为 500 埃左右，甚至只有 50 埃的超薄切片。超薄切片的制备程序与光 学显微镜的切片程序类似，但各步骤的要求以及所使用的试剂和操作方法有很大差别。 固定 选用适宜的物理或化学的方法迅速杀死组织和细胞，力求保持组织和细胞的正 常结构，并使其中各种物质的变化尽可能减小。固定能提高细胞承受包埋、切片、染色以及 电子束轰击的能力。主要固定方法有： ① 快速冷冻，用致冷剂（如液氮、液体氟利昂、液体丙烷等）或其他方法使生物材料 急剧冷冻，使组织和细胞中的水只能冻结成体积极小的冰晶甚至无定形的冰──玻璃态。这 样，细胞结构不致被冰晶破坏，生物大分子可保持天然构型，酶及抗原等能保存其生物活性， 可溶性化学成分（如小分子有机物和无机离子）也不致流失或移位。用冷冻的组织块，可进 行切片、冷冻断裂、冷冻干燥和冷冻置换等处理。用此法固定的样品既可提供组织、细胞结 构的形态学信息，又可提供相关的细胞化学信息。②化学固定，固定剂有凝聚型和非凝聚型 两种，前者如光学显微术中常用的乙醇、二氯化汞等，此法常使大多数蛋白质凝聚成固体， 结构发生重大变化，常导致细胞的细微结构出现畸变。非凝聚型固定剂包括戊二醛、丙烯醛 和甲醛等醛类固定剂和四氧化锇，四氧化钼等，适用于电子显微。它们对蛋白质有较强的交 联作用，可以稳定大部分蛋白质而不使之凝聚，避免了过分的结构畸变。它们与细胞蛋白质 有较强的化学亲和力，固定处理后，固定剂成为被固定的蛋白质的一部分。如用含有重金属 元素的固定剂四氧化锇（也是良好的电子染色剂）进行固定，因为锇与蛋白质结合，增强了 散射电子的能力，提高了细胞结构的反差。采用一种以上固定剂的多重固定方法，如采用戊 二醛和四氧化锇的双固定法，能较有效地减少细胞成分的损失。此外，固定剂溶液的浓度、 pH 及所用的缓冲剂类型、渗透压、固定时间和温度等对固定效果都有不同程度的影响。 固定操作方法通常是先将材料切成 1 立方毫米左右小块，浸在固定液中，保持一定温 度（通常为 4 ℃），进行一定时间的固定反应。取材操作要以尽可能快的速度进行，以减少 组织自溶作用造成的结构破坏。对某些难以固定的特殊组织，如脑、脊髓等，最好使用血管 灌注方法固定，即通过血管向组织内灌注固定液，使固定液在组织发生缺氧症或解剖造成损 伤之前，快速而均匀地渗透到组织的所有部分。灌注固定的效果比浸没固定好得多。 脱水 化学固定后，将材料浸于乙醇、丙酮等有机溶剂中以除去组织的游离水。为避 免组织收缩，所用溶剂需从低浓度逐步提高到纯有机溶剂，逐级脱水。 浸透 脱水之后，用适当的树脂单体与硬化剂的混合物即包埋剂，逐步替换组织块中 的脱水剂，直至树脂均匀地浸透到细胞结构的一切空隙中。 包埋 浸透之后，将组织块放于模具中，注入树脂单体与硬化剂等混合物，通过加热 等方法使树脂聚合成坚硬的固体。用作包埋剂的树脂有甲基丙烯酸酯、聚酯和环氧树脂等。 最广泛使用的是某些类型的环氧树脂，如 618 树脂、Epon812 、Araldite 和 Spurr 等商品树 脂。它们具有良好的维持样品特性