电融合法制备骨肉瘤融合细胞瘤苗的特性分析论文.docVIP

　　电融合法制备骨肉瘤融合细胞瘤苗的特性分析论文 【摘要】 目的 本研究旨在制备骨肉瘤融合细胞瘤苗并检测其体外生物学特性。方法 应用电融合技术制备UMR106细胞与大鼠巨噬细胞的融合细胞，经过磁性分选后，流式细胞仪检测融合细胞的DNA含量和表面抗原的表达。细胞培养检测融合细胞的克隆形成能力，并体外测定其诱导CTL的杀伤活性。结果 电融合与磁性分选技术相结合可获得95%的融合细胞纯度。流式细胞仪测定表明，融合细胞可表达较高的MHCⅠ、Ⅱ类抗原。其软琼脂克隆形成能力明显降低（UMR106,29.2±7.2,融合细胞，17.6±5.1,P＜0.05）,而诱导CTL细胞杀伤的能力则显著提高（100∶1时UMR106 13.4±3.2，融合细胞 42.9±7.5,P＜0.05）。结论 骨肉瘤融合细胞可稳定生长，在体内诱导CTL细胞产生较强的抗肿瘤活性.freelacrophages agic cell sorting unit etry.The colony assay of the cells and the analysis of CTL activity induced by fusion cells in vivo ed.Results The higher cell fusion efficiency can be obtained agic cells sorting unit. The fused osteosara cells expressed more MCHⅠ、Ⅱ and formed less colony on soft arga.Those cell intensively induced the CTL activity against .The cells can be used as vaccine in osteosara treatment evaluation on animal models. Key or vaccine; Cell fusion 0 引言 复发和肺转移是威胁骨肉瘤患者生命的主要矛盾［1］,为此，有必要探讨主动性免疫治疗在骨肉瘤患者中应用的可能性。由于尚未发现明确的骨肉瘤特异性抗原，因此将经过修饰的骨肉瘤细胞作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的治疗途径值得探讨［2］。 本研究应用电融合技术制备骨肉瘤与抗原提呈细胞（主要是巨噬细胞，树突状细胞研究另文报告）的融合细胞，并对其相关的免疫学特性加以研究，为其作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤患者的治疗提供理论指导。 1 材料和方法 1.1 实验材料及仪器 大鼠骨肉瘤细胞系UMR106购自美国ATCC（American Tissue Culture Collection）;大鼠MHCⅠ、Ⅱ单抗，大鼠巨噬细胞CD68单抗，羊抗小鼠IgGFITC均为英国SEROTEC公司出品；RPMI1640培养基和胎牛血清为Invitrogen公司生产，3HTdR为上海原子能研究所产品。SD大鼠购自第四军医大学实验动物中心，雄性个体5只，平均体重136克。ECM2001型细胞融合仪购自美国BTX公司；MACS磁分选仪和试剂盒由德国Miltenyi Biotec GmbH生产。 1.2 细胞培养 肿瘤细胞和融合细胞均培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，0.25%胰蛋白酶消化传代。 1.3 巨噬细胞分离 拉颈处死成年SD大鼠，全身70%乙醇灭菌后在超净台中剪开腹腔，用滴管加入10ml RPMI1640不完全培养基灌洗，小心吸出培养基1 000r/min,离心5min收集巨噬细胞，培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。 1.4 细胞融合 应用细胞融合仪按1∶5融合巨噬细胞和UMR106细胞。使用3.2mm融合电极，AC为30 V 10s;DC为640 V 30μs;2个脉冲。其他操作参见仪器说明书。 1.5 融合细胞的筛选和分离效果检测 应用MACS磁性分选仪和MS+分选柱，按CD68单抗分选试剂盒使用说明操作，分离出CD68+细胞。分选出的细胞做连续传代排除未融合的巨噬细胞，获得相对较纯的融合细胞（MUFs）。 将上柱前的细胞、CD68结合细胞和未结合细胞各1×105个，用PBS洗1次并悬浮在80μl PBS中，加入20μl FITC标记的羊抗鼠IgG,孵育10min后PBS洗2次，在400倍荧光显微镜共计数200个细胞（四个视野），根据公式计算回收率和纯度［3］。 回收率=100×(N1×P1)/(N0×P0),其中N1为洗脱段的细胞数，P1为洗脱段阳性细胞百分率，N0为上柱前细胞总数，P0为上柱前阳性细胞百分率。 1.6 DNA含量测定和染色体计数