172-郑照丞-质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定-2014级预防医学-第3实验室.docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 郑照丞 学 号： 3140090172 专业年级： 2014级预防医学 组 别： 第三实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 实验目的 2、掌握碱裂解法提取质粒的方法 ； 3、了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 ； 4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。 二、实验原理型。其中，II型识别和切割的核苷酸序列专一限制性核酸内切酶识别序列，其识别位点长度为4～6个核苷酸的回文序列。本实验中用到的两种酶类：EcoRⅠ和HindⅢ就是II型限制性核酸内切酶，可将质粒DNA割成不用大小片段。 不同质粒DNA有不同的核苷酸序列，因而其酶切位点和数量也不同。水浴酶切后，对其产物进行凝胶电泳的鉴定，根据在电泳凝胶中的区带数和片段的迁移率与已知的DNA为对照，判断酶切片段的大小，从而进行质粒的鉴定。 三、材料与方法’ GTA　AAA　CGA　CGG　CCA　GT 3’ 反向: 5’ CAG　GAA　ACA　GCT　ATG　AC 3’ 2、2×Premix Taq： Taq酶：5U/μl 4×dNTP: 各10mmol/L 10×缓冲液（buffer）: 500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl 3、灭菌去离子水 4、菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T) 5、PCR仪、 台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶成像系统 6、溶液 P1（S1)、溶液 P2 (S2） 、溶液 P3（S3）、去蛋白液 PE（W1)、漂洗液 WB(W2）、洗脱液 EB（Eluent） 操作流程图： 1.PCR 2. 质粒DNA的提取与制备 3. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法） 4.质粒DNA的酶切鉴定 5.琼脂糖凝胶电泳 操作步骤： ①PCR: 菌液煮沸10min, 冷冻，室温解冻后离心取上清, 取0.2 ml PCR反应管一只, 用微量加样枪加取灭菌去离子水5.5(l、2*Premix Tap12.5 (l、引物1-SO100 (10 (mol/L) 1 (l、引物2-SO101 (10 (mol/L) 1 (l、菌液5 (l。将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作：①94℃预变性5分钟后开始以下循环 ②循环为9430 秒，5030 秒，721 分钟。循环为30次 ③72℃ 5 分钟 ④4 ℃ 保温 ②质粒DNA的提取： 取1.5ml菌液于Eppendorf管中13000rpm离心1min，弃上清，加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮，加入250μl 溶液S2，颠倒4～6次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮，加入400μl 溶液S3，立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min，小心取上清液700μl，将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液，加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液，向吸附柱中加入500μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液，空柱13000rpm离心1min， 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液EB(Eluent)，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用。 ③质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）： 设定样品的稀释倍数20倍，即5μL质粒DNA+95μL蒸馏水，蒸馏水作为空白对照将紫外分光光度计调零，按照事先的稀释倍数加入蒸馏水，将样品稀释成适当浓度，加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。 ④质粒DNA酶切鉴定： 在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂 无菌水9.0μl、10×M酶切缓冲液 2.0μl、 质粒DNA 7.0μl、 Hind III (15U/ul) 1.0μl、 EcoR I (12U/ul) 1.0μl ⑤琼脂糖凝胶电泳： 取质粒DNA、经酶切反应后的DNA片段和PCR扩增的DNA各6μl于三个EP管中并做好标记，往Gelview染料取出凝胶紫外光下观察拍照 注意事项： 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使制板变形；胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔；电泳前，确认样品孔位于电场负极；点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多；Geldview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，