葡聚糖磁流体热处理对小鼠H22移植瘤生长的影响及机制初探论文.docVIP

　　葡聚糖磁流体热处理对小鼠H22移植瘤生长的影响及机制初探论文 【摘要】 目的 探讨磁流体热处理对小鼠H22移植瘤生长及血管内皮生长因子（VEGF）表达和凋亡状况的影响。方法 将接种了H22肝癌细胞的小鼠随机分为4组。对第4组移植瘤内注射葡聚糖磁流体，在55kHz，20kA/m交变磁场中作用10min。第1、第2、第3组作为对照，分别对瘤内注射盐水不加磁场，注射盐水加磁场和注射磁流体不加磁场。两周后处死动物，称瘤重，计算抑瘤率。另两组动物分别瘤内注射磁流体和等体积盐水，作为处理组和对照组.freell，4d后随机分为4组，每组8只。1组注射生理盐水不加磁场；2组注射生理盐水加磁场；3组注射磁流体不加磁场；4组注射磁流体加磁场。分别对小鼠移植瘤内及瘤周分5点注射0.2ml葡聚糖磁流体（含24.16mg磁性粒子，粒子平均直径为15nm，自制）或等体积生理盐水后，置于交变磁场中（纳米超顺磁热疗仪，自制，磁场强度55kHz，20kA/m），作用一次，10min。每组随机抽取3只动物，用光纤温度计（FTI10光信号处理器和FOTM医用光纤温度传感器，FISO公司，加拿大）实时监测移植瘤中心部位的温度，另3只监测直肠温度。两周后处死动物，称瘤重，计算抑瘤率。 抑瘤率＝（对照组瘤重 － 处理组瘤重）/对照组瘤重×100 % 另两组动物如前法接种，分组，注射，分别瘤内注射0.2ml磁流体和等体积生理盐水，在经磁场处理后1h、5h、24h、48h和336h处死，每次3只，以注射但未经磁场处理1h后的动物作为对照，检测组织中的VEGF表达和凋亡情况。 1.3 组织学观察 对肿瘤组织的石蜡切片做HE染色后，进行组织学观察。 1.4 VEGF表达检测 1.4.1 免疫组化法 对肿瘤组织的石蜡切片做免疫组化检测。一抗为兔抗小鼠VEGF多抗（购自友谊中联生物科技有限公司），二抗为生物素标记的羊抗兔IgG（购自华美生物工程公司）。以磷酸盐生理盐水缓冲液（PBS）代替一抗作为对照。 1.4.2 流式细胞分析 将肿瘤组织研过铜网，用PBS缓冲液制成细胞悬液，调细胞浓度为1×106/ml，加入兔抗小鼠VEGF抗体，作用1h，PBS洗3次，加入FITC羊抗兔IgG（购自华美生物公司）30min，PBS洗3次，过滤，上机检测。（FACS Aria 流式细胞分析仪，BD公司，USA，激发光波长488nm），以PBS代替一抗作为对照。 1.5 凋亡检测 1.5.1 原位凋亡检测 对肿瘤组织的石蜡切片做原位凋亡检测，TUNEL法（TUNEL试剂盒购自华美生物公司）。 1.5.2 流式细胞分析 肿瘤组织用PBS研过铜网制成细胞悬液，调细胞浓度为1×106/ml，加入碘化丙啶（PI）染色，过滤，上机检测。 2 结果 2.1 磁热处理对移植瘤生长的影响 磁流体加磁场组瘤内温度可以达到46℃～48℃。磁热处理后各组的瘤重，见表1。与3个对照组比较，磁流体加磁场组抑瘤率均大于30%，但只与盐水组比较，差异有显著性P 0.05。 表1 经磁热处理后各组的瘤重（略） 1. 注射生理盐水；2. 注射生理盐水加磁场；3. 注射磁流体；4. 注射磁流体加磁场（*P 0.05） 2.2 组织学检测 瘤内注射后磁流体可以渗透到临近的肿瘤组织中，但分布不是很均匀。磁流体本身没有引起组织细胞坏死。比较磁热处理1h和48h后的组织切片，可见，处理后随时间推移，坏死的组织面积增大。与注射盐水加磁场处理后48h时的组织相比，注射磁流体加磁场作用48h后，坏死的肿瘤组织面积大，且主要分布在磁流体周围。各组肿瘤组织的HE染色结果，见图1。 2.3 VEGF检测 2.3.1 免疫组化法 检测磁热处理后，不同时间点移植瘤组织中的VEGF表达情况，可见，注射磁流体组与注射盐水组表达强度差异并不显著。磁热处理24h后组织的VEGF表达，见图2。 2.3.2 流式细胞分析 分别检测磁热处理1h、5h、24h、48h和336h后，盐水加磁场和磁流体加磁场组肿瘤组织中VEGF的表达情况，结果见图3。不同时间点间差异无显著性。相同时间点，各处理组与对照组表达量比较，差别均无显著性，与免疫组化的检测结果一致。 图3 流式细胞分析经磁场处理后肿瘤组织的VEGF表达情况（略） 2.4 凋亡检测 2.4.1 原位凋亡检测 磁热处理后不同时间点，磁流体加磁场组与盐水加磁场组和磁流体组比较，凋亡细胞数基本相近。磁热处理后48 h组织的原位凋亡情况，见图4。 2.4.2 流式细胞分析 分别检测磁热处理后1h、5h、24h、48h和336h盐水加磁场和磁流体加磁场组肿瘤组织中的凋亡百分比，结果见图5。 图5 流式细胞分析经磁场处理后肿瘤组织的凋