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　　血管形成的测定方法论文 王会萍，李卫东，王丽京 【关键词】 血管形成 测定方法 血管形成是从已经存在的血管床中通过内皮细胞增殖和迁移,以芽生或非芽生的方式生成新生血管系统的过程，与正常的生理过程(如伤口愈合、胚胎发育等)和许多病理过程(如肿瘤的生长和转移、类风湿性关节炎、脑和心血管等疾病)密切相关1, 2。血管形成中的主要细胞是内皮细胞，它存在于所有的血管上，通过内皮细胞的迁移、增殖、分化和结构重建构成了新的毛细血管网。除内皮细胞在血管发生过程起重要作用外，支持细胞(如肿瘤细胞、外周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞)、细胞外基质、血液细胞和体液成分也都与血管的发生有关。因此，血管发生的测定非常复杂。当今尚未有任何一种体外的实验方法能精确地模拟这一复杂的过程.freelethylthiazol2yl) 2,5diphenyltetrazolium bromide, MTT 〕还原法，又称MTT比色法，是一种最常用的检测细胞存活和生长的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT结晶形成量与细胞数成正比。该方法已被用于检测活细胞增殖，并广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等5。 与之相比，3H 胸腺嘧啶掺入法是一种更好的测定细胞增殖的方法。将同位素氚标记的胸腺嘧啶核苷(3HTdR)作为DNA合成的前体掺入到增殖细胞中,通过放射自显影观察细胞增殖情况。传统的以5溴脱氧尿苷(BrdU)作为核苷酸取代胸腺嘧啶掺入到新生成细胞的DNA中，通过用单克隆抗体检测与DNA结合的BrdU ，反映细胞增殖状态的方法，虽然较以上方法有所进步，但其仍或多或少的受外源性示踪物的影响6。同时细胞增殖的变化可能是由细胞毒性而非测试药物的影响作用，因此结合细胞增殖测定法和细胞凋亡检测法的特点，可能会获得更为精确的结果。 1.2 内皮细胞迁移测定法 目前，对血管内皮细胞迁移的影响，已经有很多有效的测定方法。其中以改良的Boyden Chamber 或Trans) 硝酸纤维素薄膜的细胞数量,确定细胞迁移能力。近年来虽然又有新型Millicell HA 底膜培养皿式双室联合培养系统出现,但是它们的原理一样,利用细胞穿过微孔滤膜来观测一种细胞对另一种细胞迁移的影响。 划痕损伤的方法在国外出现较早。用移液器滴头或刀片在单层血管内皮细胞的培养皿上划痕，为边缘内皮细胞迁移提供一裸露区域。经过创伤后边缘的单层内皮细胞可迁移至创伤区域，并重新形成新的单层内皮细胞层。在光镜下计数从损伤边缘迁移出的细胞数和迁移的相对距离，并计算出细胞的实际迁移距离。然而这种方法的定量具有任意性。 1.3 成管测定法 血管形成中最典型的测定是对内皮细胞形成三维结构能力的测定。在体外给予适合的细胞外基质成分，内皮细胞能形成管状结构。在含有胶原和纤维蛋白凝块的塑料培养皿中，内皮细胞初期在水平面形成细胞条索结构，经过12 h或更长时间培养，细胞条索开始向上发出分支，贯穿凝胶形成三维的管状网络结构8。在一系列的血管发生测定中，成管测定占有重要的位置9, 10。内皮细胞不仅能在二维空间形成毛细管，也能在三维空间对细胞行为进行定量分析，这更为接近体内细胞生长的环境。定量分析包括在凝胶中从下到上对不同长度管进行拍照，测量每个管的长度(水平面上的宽度和垂直面的高度)和管的最大直径等。 1.4 器官培养测定法 器官培养方法极大地推进了对血管形成的测定。器官血管形成测定法包括鼠主动脉环、鸡主动脉弓、猪颈动脉、胎儿鼠骨移植测定法等。这些测定法非常相似，其中鼠主动脉环测定应用最为广泛。在体外，通常把分离的器官片段、胎盘或部分器官放于含有待检测物质的基质(如纤维)中培养，10～14 d后，可检测内皮细胞生长形成血管，通过测量移植体的长度和形成微血管的数目来定量测定血管的发生11。然而，血管定量测定也非常困难，因为微血管的向外生长总是成簇在一起，因此它们所覆盖的区域就很难测定。 2 血管形成的体内测定方法 以上叙述的一系列体外测定方法已被用来研究血管形成的不同方面，然而对不同来源内皮细胞的分离和体外培养发现，不同来源的血管内皮细胞对各种外界因素的反应不同。体外培养的内皮细胞行为和形态受到多种实验参数的影响：基质的自然状况、所用培养介质及血清的类型、各种外界因素、收集细胞的方法以及传代次数等。因此，近年来体内实验系统被广泛地重视和应用，并且得到迅速发展。在以往发表的很多文章中，大量的体内测定法已经被详细的描述过，笔者结合最新的进展作进一步的详述。 2.1 背侧皮肤/气囊模型测定法 背侧皮肤/气囊模型是用来检测药物对由体内癌细胞所触发的新生血管生