血管钠肽抑制低氧刺激心成纤维细胞c┐fos的表达论文.docVIP

　　血管钠肽抑制低氧刺激心成纤维细胞c┐fos的表达论文 郭海涛 朱妙章 吕顺艳 于军 董明清 高瞻 施溥涛 【关键词】,.freelL L-1）、VNP组（10-8～10-6mol L -1）和VNP（10-6mol L-1）+低氧组.以免疫组织化学染色方法观察各组c-Fos的表达情况，采用激光共聚焦方法测定了［Ca2+］i水平.结果①低氧组较对照组可以显著升高Fos样免疫阳性细胞数及染色强度（P 0.05）;②VNP预处理心成纤维细胞可以减弱低氧的作用（P 0.05vs低氧组），但Fos的表达量仍高于对照组（P 0.05）;③对照组［Ca2+］i水平无显著变化，低氧组［Ca2+］i水平显著升高，而VNP能使升高的［Ca 2+］i水平较对照组和低氧组显著降低（P 0.05）.结论VNP能减弱低氧对心成纤维细胞生长的刺激作用，其机制可能与Ca2+等信号转导分子及c-fos表达有关. Keyofthepresentculturedneonatalrats.Theculturedcardiacfibroblastslyintofourgroups:Controlgroup.freelL L-1），VNPgroup（10-8～10-6mol L-1）andVNP（10-6mol L-1）+hypoxiagroup.Thec-Fosexpres-sionofcardiacfibroblastseasuredbythemeansofim-munocytochemistry，［Ca 2+］iconcentrationeasuredbythemeansofinteractivelasercytometer.Thestudiesper-formedeangreyofcardiacfi-broblasts（P 0.05vscontrolgroup），VNPdecreasedthepositivecells（P 0.05vscontrolgroup）anddecreasedthelevelof［Ca2+］iinVNP+hypoxiagroup.Thesefindingsindi-catethatVNPcanattenuatehypoxia-inducedexpressionofc-fosgeneincardiacfibroblastsa公司，c-Fos抗体购于SantaCruz公司，ABC试剂盒购于博士德公司，LE-ICAO500MC图像分析仪购于德国Leica公司. 1.2方法 1.2.1主要药物配制VNP:用生理盐水配成10-3mol L-1的原液，4℃保存，实验前用DMEM培养基稀释成工作液.DMEM培养基:按说明书配置，用0.1mol L-1的盐酸调pH至7.2～7.4，4℃保存备用.小牛血清:56℃灭活30min，-20℃保存.胰蛋白酶:用生理盐水配成2.5g L-1的溶液，4℃保存备用.EDTA:用生理盐水配成0.4g L -1的溶液，4℃保存备用.胶原酶:用生理盐水配成1.5g L-1的溶液，4℃保存备用. 1.2.2心成纤维细胞培养无菌条件下取出乳鼠的心脏，剪碎，以1.25g L-1胰蛋白酶及0.75g L-1的胶原酶消化成单细胞悬液，离心（1000r min-1，5min），用含0.1mmol L-1BrdU及100mL L-1灭活小牛血清的DMEM培养基重新悬浮，贴壁90min后将悬浮细胞吸弃，加入含100mL L-1灭活小牛血清的DMEM培养基传代至2～4代时，将心成纤维细胞以5×107L-1接种于24孔培养板（预置10mm×10mm的盖玻片，用于免疫组化染色）或100mL的玻璃培养瓶（用于传代），或以1×107L-1，每皿0.3mL接种于培养皿之后，移入37℃，50mL L -1CO2培养箱中培养.若细胞贴壁并已伸展但未汇合（sub-confluent），用台盼蓝拒染法检查活细胞数大于 95%，继续以后实验. 1.2.3细胞低氧培养方法将接种于培养瓶或培养板的细胞放置于一体积约7L的真空干燥瓶中，通入950mL L-1N2和50mL L-1CO2的混合气体，以2L min-1，通气12min，使真空干燥瓶中气体浓度达到20～30mL L-1O2和50mL L-1CO2，并可持续24h. 1.2.4免疫组织化学染色药物及20～30mL L-1O2低氧作用2h后，以40g L-1的多聚甲醛固定（4℃，20min），然后以15g L-1的正常羊血清孵育30min以封闭组织中的抗体非特异性结合位点.将2g L-1BSA/0.5g L-1NaN3/PBS稀释的FOS抗体（1∶1000）加至玻片上，4℃孵育48h，再依次在生物素化抗IgG（1∶400）和ABC液（1∶200）中