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第三章 固定化酶及反应动力学.ppt 226页

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第三章 固定化酶及反应动力学
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* * * * * * * * * 此时相当于将酶集中于反应器的某一部分空间内。因酶浓度与反应速率的正比关系,所以在底物浓度均匀时酶的不均匀分布对总速率无影响。一级动力学底物浓度亦与速率成正比,为何影响总速率? * ③ 不用载体法 这是选择适当的条件,通过一定处理使酶固定在细胞内的—种方法。如葡萄糖异构酶是一种胞内酶,将生物细胞加热至60℃,10min,其他酶失活,则该酶被固定在细胞内,所以又称加热固定化。又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内,若再用壳聚糖处理,使之凝聚干燥即成固定化细胞。 2 辅基与辅酶的固定方法 2.1辅基的固定方法 对于与酶结合牢固的辅基,可以考虑在固定化酶时一般可以将辅基同时固定,但是在一些条件下.如酶蛋白与辅基结合弱而辅基容易泄露时,或者用于亲和层析来分离纯化相应酶等,必须将辅基固定。辅基固定化过程是,将载体与连接臂连接,再以适当反应与辅基连接。裁体应符合以下条件: 没有非专一件吸附,具有多孔性和—定的机械强度;具有适合与臂或辅基结合的功能基团;具有化学和生物学稳定性等.载体大多采用琼脂糖,也使用纤维素、多孔玻璃珠或合成高分子材料等。连接臂,尚需考虑其疏水性、亲水性、离子性和体积、长度等因素。选择偶联反应有两种情况: —是在不影响辅基活性条件下,引入适当的功能基团,如羧基或氨基等容易与载体连接;二是如果辅基分子本身具备有参与催化活性的功能基团,无须再引入功能团。如磷酸吡哆醛(胺)、FAD、FMA、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等,大都利用分子本身原有的功能基团。接着,将具有某种功能团的辅基与连接臂结合,再与活化载体结合.用琼脂糖为载体时.有如下反应: 2.1.1溴化氰法 活化载体可直接与辅基偶联。 2.1.2带羧基载体 2.1.3带氨基载体 2.1.4带巯基或二硫基裁体 2.1.5带芳香氨基线体 2.2辅酶的固定方法 辅酶的固定方法主要有两种:载体结合法和包埋法。载体结合法与捕基固定方法相似,主要用于制备亲和吸附利。包埋法中,由于辅酶相对分子质量小,先将辅酶与水溶性高分子结合,然后再来包埋。这种包埋和酶的包埋法相似。因此,辅酶固定化包括:引入一个功能基团,生成辅酶衍生物,再与水溶性高分子聚合物结合。 2.2.1引入功能基团 对于一些腺苷酸的辅酶,如NAD+、NADP+、CoA和ATP等,在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。其反应分别如下: 2.2.2高分子化 选择高分子化合物时,首先要考虑的是 其溶解度大、分子大小适当,既能保持在半适膜内,又不会过大地增加粘度而影响活性;其次是,高分子大小、结构、亲水性、解离基团、结合量等都影响高分子化辅酶的活性。一般引入羧基的辅酶,用碳二亚胺缩合反应使其与聚Lys、聚乙亚胺结合,形成水溶性高分子化合物;引入氨基的辅酶, 一般用BrCN活化后,再与水溶性多糖类(如右旋糖苷)结合,而高分子化。 酶反应器中,使用高分子辅酶衍生物还有捕酶的再生 问题。一般采用与主反应共组合和独立进行二种方式来解决。如下页图: 在实践中,许多重要的生物活性物质或生化药物的生物合成中,尚需辅酶参加酶反应,所以,辅酶的固定化和固定化辅酶的再生是酶工程的一项重要任务。目前.尚未见用于工业生产的报道。 3 动植物细胞固定化 3.1植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多,需要温和的固定化方法。80年代开始研究,目前一般采用吸附法和包埋法(下表 )。 3.1.1吸附法 吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内。或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间,培养液及O2在中空维管内流动,透过中空纤维管壁(具半透膜性),传递给附着于外壁的细胞,细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究,可连续使用1个多月。又如将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中,振荡培养一 段时间,细胞吸附于塑料孔洞内,并能生长繁殖。 3.1.2包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。 Brodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞。 3.2 动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩.需要最温和的固定化方法。目前,动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种,其中吸附法用的最多。 3.2.1吸附法 由于大多数动物细胞属于附着细胞,它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此,吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。主要载体及固定方法有: (1)转瓶法。转瓶是由玻璃或塑料制成。其表面经一定处理而带有电荷,如用高锰酸钾等氧化剂,强酸、强碱或紫外辐

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