PCR-DGGE技术剖析.ppt

聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳 PCR-DGGE （Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 汇报人： 学号： 环境微生物新技术 目录 （一） DGGE的简介 （二） DGGE的定义 （三） DGGE的基本原理 （四） PCR-DGGE的操作流程 （五） DGGE的优缺点 （六） DGGE的应用 变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。 DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。 具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性， 因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标记方法。 使用对象：长度相同但序列不同的DNA片段 变性剂：尿素和甲酰胺 　　DGGE不是将分子量不同的DNA分开,而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。 原理：根据DNA的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。 　　DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。 核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值取决于DNA分子中G-C含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60℃，变性剂0~100%。 DGGE的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使实验无法检出存在于高TmDNA片段中的碱基替换。为了解决此问题。可以在一个PCR引物的5端设计一段富含G-C的尾巴，从而使扩增产物富含G-C碱基对（30~40bp),保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE的突变检出率接近100%。 根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE和平行DGGE （1）垂直DGGE，变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围; （2） 平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测 DGGE的分类 环境样品基因组DNA的提取 目标片段的PCR扩增 DGGE图谱的分析 图像的采集和条带的回收 DGGE 分析 电泳前准备工作 电泳分析 剥胶、染色 DGGE条带测序 总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合的DNA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要。 适合DNA提取方法的考量：①DNA的得率 ②能否进行PCR扩增以及扩增的重复性 ③制备DNA花费时间的长短。 关于DNA提取的建议： 优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用酶解/酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购买Qiagen公司相关产品） 。 选择适合的目标片段，设计合适的引物，注意有GC夹子情况下引物二聚体的行程。 环境样品目标片段的扩增最好采用