第六篇水产动物病原的检测技术.pptVIP

第六章 水产动物病原的检测技术;第一节 免疫学检测;一、Ag-Ab反应的一般规律和特点;（三）Ag-Ab的结合比例与“带现象” Ag - Ab结合需有适当比例-----最适比，形成的结合物体积大、数量多，出现肉眼可见的反应。即Ag - Ab反应的等价带。 若Ag 或Ab过多，比例不适，不能出现肉眼可见反应-----“带现象”。 Ab过剩---------前带， Ag 过剩--------后带。;;二、影响Ag-Ab反应的主要因素; 三、免疫凝集试验（凝集反应） ;（一）直接凝集试验;常用已知Ab测未知Ag。可用于细菌的鉴定、ABO血型分型;2、试管法：定量 （测定抗体的效价）;（二）间接凝集试验 可溶性Ag吸附在载体表面 + Ab → 凝集 （致敏颗粒） 可用来检测微量存在的Ab 载体：红细胞--------------------------间接血凝试验 聚苯乙烯乳胶颗粒-----------间接凝胶凝集试验 硫酸铝、活性炭; 载体 可溶性Ag 致敏颗粒 Ab 致敏颗粒凝集 ;（三）间接凝集抑制试验;;（四）协同凝集试验;;四、免疫沉淀试验（沉淀反应）;（一）环状沉淀试验;（二）琼脂扩散试验;1、双向琼脂扩散;; 特点：敏感性不高，所需时间较长。可用于： （1）定性检测可溶性Ag或Ab。 （2）对复杂的Ag、Ab的提取纯度进行分析鉴定。 ; 2、单向琼脂扩散 将已知抗体与琼脂混匀 特点：操作繁琐;3、对流电泳 双向琼脂扩散+电泳技术 试验在装有PH8.6缓冲液的电泳槽中进行。;;4、火箭电泳 单向琼脂扩散+电泳 缓冲液PH8.6;;;本试验样品用量小，特异性高，分辨力强，主要用于血清蛋白及抗体成分的分析研究; 五、与补体相关的试验;Ag;六、酶联免疫吸附试验（ELISA） Ag-Ab+酶→底物显色→用酶标测定仪分析 优点：敏感性高，特异性强，可定性、定量。 常用酶及底物： 1、辣根过氧化物酶（HRP） 底物：邻苯二胺（OPD）-------------------黄色。 四甲基联苯胺（TMB）-------------金黄色。 2、 碱性磷酸酶（AP） 底物：对硝基苯磷酸盐（PNPP）---------黄色。 ;（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）抗原竞争法;（一）直接法 抗原（抗体）+ 酶标抗体（抗原）;（二??间接法 用已知Ag检测未知Ab的效价。 已知Ag吸附于载体 洗涤 加被检血清，Ab与Ag结合 洗涤 加酶标二抗，使与Ag-Ab复合物结合。 洗涤 加底物显色 ;酶标板;第一节 免疫学检测;;E E E;七、免疫荧光技术;（一）直接法 含未知Ag待检标本（固定在玻片上）+已知荧光Ab→洗去 游离的荧光Ab→干燥后，荧光显微镜下观察。 优点：方法简便、特异性高。 缺点：敏感性偏低、如检测多种Ag需制备多种相应的 荧光抗体标记。 ;已知荧光Ab;（二）间接法 待检样品（未知Ag） +Ab（已知）→荧光标记抗Ab→ 冲洗、干燥、荧光显微镜下观察。 优点：敏感性高，制备一种荧光标记抗Ab即可对多种 Ag-Ab系统进行检测。 缺点：易出现非特异性荧光。; ;免疫荧光抗体技术检测兔抗血清结果;;;一、定义 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）： 在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件 下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。;二、反应体系和过程 1、PCR反应缓冲液 2、模板DNA 3、引物 4、Taq DNA