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实时荧光定量PCR
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实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
目录
实时荧光定量PCR原理
内标在传统定量中的意义
内标对荧光定量PCR的影响
PCR仪在国内的发展状况
产品突出特性
展开
编辑本段实时荧光定量PCR原理
所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示)。
2. 荧光域值(threshold)的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold = 10 ′ SDcycle 6-15
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时定量PCR是测量PCR产物多少的,跟什么DNA半保留复制没有关系。
fold指“倍数”,比如PCR产物是原来的2倍,那么fold=2,log2(fold)=1;4倍,那么fold=4,log2(fold)=2。对数是啥不用解释了吧...
其实就是把纵坐标缩小了而已,这样作图比较容易。比如产物变为1024倍,要是这么作图纵坐标要画到1024,想想吧...但是log2(fold)=10,画起来比较容易。
罗嗦一句,做PCR的话,产物基本都是原来的几十万倍....
Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn:△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn = Rn –基线)。
4. 荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:
1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2)SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
编辑本段内标在传统定量中的意义
1. 几种传统定量PCR方法简介:
1)内参照法:在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板。
2)竞争法:选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3)PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的。
2.内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,
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