5.3-血红蛋白的提取和分离.pptVIP

2）凝胶色谱柱填料的处理 计算凝胶量 配置凝胶悬浮液 装填 洗涤平衡 ↓ ↓ ↓ 凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 注 意 缓冲液液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。 注 意 装配好的凝胶柱 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究。 在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 思考 要，如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。 你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？ 思考 3）样品加入与洗脱 ①缓冲液缓慢下降 50cm高 ②加透析样品 ③样品渗入凝胶床 ④洗脱 ⑤收集 ②加透析样品 注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁环绕移动 注 意 收集得到的纯化后的蛋白 1、提取生物大分子的基本过程和方法； 2、凝胶色谱法、电泳法的原理。 1、凝胶是什么？ 　　一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、原理： 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 一 基础知识 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 　　当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ 　）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 相对分子质量较小 即：移动速度与相对分子质量成_____。 反比 　　能够抵制（ ）对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。 外界的酸或碱 PH值 1、概念： 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 ㈡ 缓冲溶液： 2、作用： 　　通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ 　　　）就可以制得（ ）使用的缓冲液。 1－2 使用比例 在不同PH范围内 3、缓冲溶液的配制 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 说出人体血液中缓冲对。 思考 1、概念： 　　指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 ㈢电泳： 2、原理： 　　 许多重要的生物大分子，如( )等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上( ) 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其( ) 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子( )以及分子本身( )、( )的不同使带电分子产生不同的( )，从而实现样品中各种分子的分离。 多肽、核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 迁移速度 一定的PH 形状 　聚丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵）和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 　　蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 分类： 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 　　为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入