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白念珠菌二相性的SAP2和PLB1基因的初步研究.pdf 46页

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白念珠菌二相性的SAP2 和PLB1 基因的初步研究 专 业: 病原生物学(微生物学) 研究生: 罗红梅 导 师: 王和 教授 苑天红 副教授 摘 要 目的通过对编码白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶2 (Sap2)的SAP2 基因和编 码白念珠菌磷脂酶B1 (Plb1)的PLB1 基因分别在该菌孢子相和菌丝相的mRNA 水 平和DNA 水平的比较,从分子生物学水平探讨编码白念珠菌侵袭性酶的两个重要 毒力基因在白念珠菌二相性中转录水平及DNA 水平的差异,为进一步研究白念珠 菌的遗传变异、致病性与防治提供初步实验依据。方法 1. 分别采用YPD 培养基 和含20%胎牛血清的RPMI 1640 培养基,诱导培养白念珠菌标准株ATCC-10231 的 孢子相细胞和菌丝相细胞; 2. 采用RNAiso Plus 试剂联合玻璃珠破壁方法,分 别提取白念珠菌的孢子相和菌丝相细胞的总 RNA; 3. 应用逆转录聚合酶链式反 应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术和凝胶 分析软件bandscan4.3,分别比较SAP2 基因及PLB1 基因在白念珠菌孢子相和菌 丝相细胞中其mRNA 水平的表达差异;4. 采用提取真菌细胞DNA 的试剂盒,分别 提取白念珠菌的孢子相与菌丝相细胞的总DNA,应用聚合酶链式反应-单链构象多 态性(Polymerase Chain Reaction -Sing leStrand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP)技术,分别比较SAP2 基因及PLB1 基因在白念珠菌孢子相与菌丝相中 其DNA 水平的差异。结果 1. 成功培养出白念珠菌标准株ATCC-10231 孢子相和 菌丝相细胞,孢子相细胞的纯度达100%,菌丝相细胞纯度在95%以上; 2. 提取 的白念珠菌孢子相细胞总RNA 纯度为1.897±0.047,浓度为1.121±0.175 (μg/ μl);菌丝相细胞总RNA 纯度为1.874±0.064,浓度为0.523±0.031(μg/ μl)。 提取的孢子相及菌丝相细胞总RNA 电泳结果均可见较为清晰的28S、18S、5S 三条 带,说明提取的白念珠菌二相细胞的RNA 完整性均较好;3. 运用半定量 RT-PCR 技术和凝胶分析软件bandscan4.3,得出SAP2 基因在孢子相和菌丝相细胞内mRNA 的相对表达量分别为0.789±0.039,0.927±0.062;PLB1 基因在孢子相和菌丝相 细胞内mRNA 的相对表达量分别为0.899±0.035,0.998±0.012;通过对数据进 3 行配对t 检验,得出SAP2、PLB1 基因在白念珠菌标准株ATCC-10231 孢子相与菌 丝相细胞中其mRNA 的相对表达量均有差异,且这两个基因在菌丝相细胞中其mRNA 的相对表达量均高于孢子相(P 均<0.01);4. 成功提取白念珠菌孢子相和菌丝 相细胞总 DNA,应用 PCR-SSCP 技术,得到的 SSCP 图谱显示:白念珠菌标准株 ATCC-10231 孢子相及菌丝相细胞SAP2 基因的电泳带型有差异,而PLB1 基因在二 相中的电泳带型无明显差异。 结论 1. 采用 YPD 培养基培养白念珠菌标准株 ATCC-10231,可得到完全纯度的孢子相细胞,采用含 20%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基培养白念珠菌标准株ATCC-10231,可诱导培养出纯度极高的菌丝相细胞; 2. 采用RNAiso Plus试剂联合玻璃珠破壁方法提取的白念珠菌孢子相和菌丝相细 胞总RNA 的浓度和纯度较高、完整性好,可以满足后续分子生物学的研究需要; 3. SAP2 基因以及 PLB1 基因在白念珠菌标准株ATCC-10231 孢子相和菌丝相中其 mRNA 相对表达量有差异,其菌丝相mRNA 表达水平均高于孢子相;4.采用提取真 菌细胞 DNA 的试剂盒,可提取到白念珠菌孢子相和菌丝相细胞总 DNA,应用 PCR-SSCP 技术得到的 SSCP 图谱显示所扩增的 SAP2 基因在白念珠菌标准株 ATCC-10231 孢子相和菌丝相的DNA 水平上存在差异,而所扩增的PLB1 基因在孢

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