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质粒的快速抽提 复旦大学上海医学院 生物化学与分子生物学系 实验原理 1 碱裂解细菌 NaOH 染色体DNA变性 SDS 蛋白质变性 实验原理 实验步骤 1 细菌扩增 在原始平板上挑取待筛选菌落,接种到含AMP的LB液体培养基中,置于37度恒温摇床以200bpm的速度振荡培养过夜. 2 收集细菌 每个Eppendorf管收集1ml菌液,12000g离心后去除上清. 以上步骤由教师完成,学生从第三步开始做. 3 重悬 每一Eppendorf管中加入50ul试剂1 (10 mM EDTA pH 8.0),在涡流震荡器上震荡30秒重悬细菌. 4 裂解细菌 每一Eppendorf管加入50ul新鲜配制的试剂2(0.2M NaOH,0.5% SDS,20% 蔗糖),震荡30秒.70度水浴5分钟. 5 沉淀细菌DNA及蛋白,分离出质粒DNA 每管加入1.5ul试剂3(4M KCL)和0.5ul试剂4(0.4%溴酚蓝溶液),震荡30秒,冰浴5分钟.4度12000g离心3分钟. 6 制备0.7%琼脂糖凝胶(含0.5ug/ml EB) 7 电泳 取上清50ul上样于样品槽,电泳(电压5-10V/cm胶),待染料迁移至全胶长度2/3-3/4时,停止电泳,紫外检测电泳结果. DNA的琼脂糖凝胶电泳 1 琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α (1-