第3章藏系绵羊smo mirna干扰载体的构建.doc

硕 士 学 位 论 文 题 目 藏系绵羊Smo 基因皮肤特异表达载体及干扰载体的构建及功能的初步分析 作 者 完成日期 2016 年 3 月 10 日 学 科 门 类 农 学 专 业 基础兽医学 研 究 方 向 动物功能基因组学 指 导 教 师 教授 学院（系、部） 生命科学与技术学院 授予学位日期 年 月 日Construction and functional analysis of skin-specific expression and interference vector of Tibetan sheep Smo gene By Yu Miao A thesis Submitted To Southwest University for Nationalities In Fulfillment of the Requirements for Master Degree Supervisor：Yucai Zheng (Professor) College of Life Science and Technology Southwest University for Nationalities Chengdu, 610041, P.R. China May 2016摘 要 本研究的目的是构建藏系绵羊Smo基因的皮肤特异表达真核载体及干扰载体，在细胞水平上探索该基因在毛囊细胞中可能发挥的调控机制，为进一步研究藏系绵羊Smo基因在毛囊发育与周期变化中的功能提供理论基础。试验以成年藏系绵羊为研究对象，从皮肤中克隆了Smo基因序列，根据基因的CDS区构建了皮肤特异性真核表达载体及3个干扰载体，随后转染体外培养的人毛囊内根鞘细胞(Human hair inner root sheath cells, HHIRSC)，利用荧光定量PCR技术检测藏系绵羊Smo基因以及Smo基因所在Hh通路的两个下游基因（Gli1、Gsk3β） mRNA水平的变化。主要研究成果如下： 获得了藏系绵羊Smo基因的编码区序列（CDS），长度为2342 bp。CDS区比对显示，Smo基因与预测的绵羊Smo基因序列有3个碱基差异，编码的蛋白质序列有1个氨基酸差异。 以pCDsRed2-KI真核载体为基础，构建了含KAP6.1皮肤特异表达启动子的Smo基因重组真核载体pCDsRed2-KS；以线性质粒pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR为主体，构建了3个干扰载体。 将表达载体和3个干扰载体分别转染HHIRSC，经荧光定量PCR检测转染结果，显示藏系绵羊Smo基因在转染pCDsR-KS载体的HHIRSC中高表达，并且Gli1基因、Gsk3β基因均在mRNA水平上显著上调（P）；3个干扰载体对Smo基因均有98 %以上的沉默效应，并且Gli1基因、Gsk3β基因均在mRNA水平上显著下调（P）。 本研究结果表明，藏系绵羊皮肤特异真核表达载体pCDsR-KS和3个干扰载体均构建成功，可用于Smo基因功能的细胞水平研究。研究结果提示，藏系绵羊Smo基因可能通过Hh通路影响毛囊的发育或周期变化。 关键词：藏系绵羊；Smo基因；真核载体；干扰载体；Gli1基因；Gsk3β基因 Abstract The objective of this study was to construct Smo gene (one of the Gasdermin gene family members) skin-specific eukaryotic expression vector and interference vector of Tibetan sheep, and to explore possible regulation mechanism of Smo in follicle cells at cellular level and to provide a theoretical basis for further studying the feature of sheep Smo genes in hair follicle development and cycling. Adult Tibetan sheep was used to clone Smo gene from the skin tissue and to construct skin-specific eukaryotic expression vecto