200 250 300 350 400 450 500 荧光激发光谱荧光发射光谱 - 湖南大学.pptVIP

第九讲　荧光及拉曼光谱在药物分析中的应用 湖南大学化学化工学院 药物分析教研室 刘浩然 内容提要 荧光分光光度计基本原理、结构及应用 拉曼光谱基本原理、结构及应用 荧光概述 荧光是指某物质经一定波长的光照射后，发出比入射波长更长的光（通常为可见光），一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。 但有些物质在入射光停止后，仍有发光现象，这类特殊的荧光则称为磷光。 具有荧光的物质特征 长共轭结构 刚性和共平面性 取代基 共轭对荧光的影响 影响荧光的其它因素 溶剂 温度 pH 浓度 荧光分光光度计的基本结构 荧光分光光度计主要由光源、激发光单色器、样品池、发射光单色器及检测器构成。 荧光分光光度计的光路图 　样品池架 比色皿 由于荧光分光光度计的入射光与出射光呈垂直，因此必须使用四通石英比色皿（即有四个光面）。普通的石英比色皿为两个光面，两个毛面。 内部构造 光源：氙灯 氙灯 高压氙灯和脉冲氙灯 荧光分光光度计一般选择氙灯作光源。有脉冲氙灯和连续氙灯两种。 荧光分光光度计的检定 灵敏度的测试（信噪比）：以纯水的拉曼峰值除以噪声值，通常至少要500以上。 波长准确性和重复性 线性：一般用硫酸奎宁为标准物质 分辨率：以汞灯来测试（由厂家工程师测试） 荧光分光光度计的保养与维护 最重要的是维护好氙灯。高压氙灯在使用完毕先用软件将氙灯关闭，至少等15min以后再将仪器主机关闭，以使其充分散热，否则氙灯寿命大大缩短。 测样时要通过调节狭缝宽度来调节好氙灯光强，避免强光将检测器损坏。 避免有腐蚀的物质损坏样品池架及光学部件。 保护好四通比色皿。 经常使用。因仪器中有马达等运动部件，长期不用易出故障。 荧光分析方法 定性测量 　　测定荧光光谱。测定未知样时，可测定三维荧光光谱来确定激发波长和发射波长。如不能测三维谱，则先固定激发波长（可设为200nm）,扫描发射光谱。得到发射光谱的峰值后，固定发射波长，再测定激发光谱，从而确定最终的激发波长。 定量测量 　　在确定好激发波长、发射波长后，配制一系列标准溶液来建立线性关系。因荧光灵敏度高，一般我们选择在激发波长片吸光度（A）为0.05的溶液作起始浓度来摸索线性范围。 荧光分析法在药学中的应用 药物的鉴别 测定制剂中的药物含量。适合于含量少且能发荧光的药物，而其它成份不干扰。 测定药物中有荧光的杂质。 用于药物或有活性的化合物与蛋白质、酶、受体等生命物质的相互作用。 示例1:维生素B1的鉴别 示例2:荧光法测定利血平片的含量 示例3:荧光衍生物法测定药物含量 其它荧光技术在药学中的应用 胶束增敏荧光分析法 同步荧光分析法 导数荧光分析法 三维荧光光谱法 荧光偏振分析法 荧光探针技术 目前有众多荧光探针处于开发和应用之中。 时间分辨荧光免疫分析 动力学荧光分析法 化学计量学荧光分析法 荧光联用仪器 除了荧光光谱仪以外，荧光原理还可用在不同的仪器上。 高效液相色谱—荧光检测器 原子荧光光谱仪：利用金属的氢化物产生荧光来定量 X荧光光谱仪：通过激发电子产生荧光来测定物质结构 X射线衍射仪：有部分仪器以NaI晶片作检测器，X射线打到NaI晶片上产生荧光，再由光电检测器测得信号，从而测定衍射光谱。 荧光成像仪：利用荧光探针与特定物质结合产生荧光，或者本身有荧光的探针与其结合进行定位。在生命科学中有较多应用。 …… 拉曼光谱 拉曼光谱概述 1928年，印度科学家拉曼发现“拉曼散射”。1930年拉曼获得诺贝尔物理学奖。拉曼在极其简陋的实验条件下作出了杰出的成绩。 拉曼散射是指一定频率的光波碰撞粒子后发生频率改变的现象。频率的变化决定于散射物质的特性。 相应的，频率未发生改变的散射光称为瑞利散射。 拉曼散射信号较弱，在激光器出现以后才迅速地应用起来。 现在其原理广泛应用到多种与拉曼散射相关的仪器中。 拉曼散射现象 拉曼光谱与荧光光谱的区别 拉曼光谱与荧光光谱都是由一定的光照射后发射而产生的光谱。 拉曼光谱峰与入射光的波长有关，荧光光谱的发射峰与入射光的波长无关（即有固定的发射峰）。 拉曼光谱与红外光谱的区别与联系 拉曼光谱与红外光谱均是分子振转能级的体现。 拉曼光谱的入射光及散射光一般均属于可见光区。 有的物质峰在某一波长处只有拉曼散射，有的只有红外吸收，有的二者兼有。因此，拉曼光谱与红外光谱在测定分子光谱方面具有互补性。 拉曼光谱光路图 拉曼光谱仪的构造 光源：激光器 拉曼目前一般采用激光为光源，因其单色性好，光强大。 　常用的激光器： 　Ar＋激光器： 488.0nm 和 514.5nm Kr激光器：568.2 nm He-Ne激光器：632.8 nm 红宝石激光器： 694.0nm 　二极管激光器：782.0, 832.0nm Nd/YAG激光器： 1064 nm 　　波长较短的前两