NY/T 678-2003猪伪狂犬病免疫酶试验方法.pdf

ICS 11.220 B 41 中华 人 民共 和 国农 业 行 业标 准 NY/T678-2003 猪伪狂犬病免疫酶试验方法 Enzymeimmunoassayforporcniepseudorabies 2003-07-30发布 2003-10-01实施 中华人民共和国农业部 发 布 NY/'C678-2003 前 A 本标准的附录A是规范性附录 本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口 本标准起草单位:农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人:王宏伟、吴清民、童光志、田克恭、陈西钊、苏敬良、卜传彬 NY/T678-2003 猪伪狂犬病免疫酶试验方法 范围 本标准规定了猪伪狂犬病E糖蛋白((gE，即gpI)酶联免疫吸附试验和免疫酶组织化学试验方法。 本标准适用于检测猪血清中的猪伪狂犬病病毒gE特异性抗体和组织中的猪伪狂犬病病毒抗原。 2 E糖蛋白酶联免疫吸附试验(gE-ELISA) 2.1 材料准备 2.1.1 试荆 a) ELISA抗原包被板; b)标准阳性血清:伪狂犬病病毒gE单克隆抗体: C) 标准阴性血清:无伪狂犬病病毒gE抗体的猪血清; d) 酶结合物:辣根过氧化物酶(HAP)标记的抗伪狂犬病病毒gE单克隆抗体; c) 磷酸盐缓冲液(PBS)配制见第A.l章: f) 洗涤液:配制见第A.2章; g) 样品稀释液:配制见第A.3章; ,1) 底物溶液:配制见第A.5章; I) 终止液:配制见第A.6章口 2.1.2 器材 a) 酶联检测仪; b) 微量加样器，容量50川一200川 ; 。) 370C恒温培养箱。 2.1.3 样品 采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染.密装于灭菌小瓶内，飞℃或一30℃保 存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用样品稀释液作2倍稀释」 2.2 操作方法 2.2.1取出包被板，并将样品位置准确记录在记录单上. 2.2.2 向AA;,A，孔中分别加人 100川_未经稀释的阴性对照血清.AA},A。孔中分别加人 100川未经稀释的阳性对照血清，其他各孔加人100川稀释好的待检样品。 2.2.3 置室温 1he 2.2.4 弃去孔内液体，再在纱布或吸水纸上拍千 2.2.5 用洗涤液将反应板洗涤(3.5)次，每次洗涤后均弃去孔内液体 最后一次洗涤后，除净孔内液 体，拍干。 2.2.6 每孔加人100川 酶结合物溶液，室温下作用20mina 2.2.7 重复2.2.4和2.2.50 2.2.8 各孔加人 100f'I_底物液。 2.2.9 室温放置 15min, 2.2.10 各孔加人50川 终止液，立即用酶标仪于650nm测定各孔吸光度(OD)值 2.3 结果判定 2.3.1 只有在阴性对照OD值的均值减去阳性对照OD值的均值大于等于0.3时，试验成立 NY/T678-2003 2.3.2 待检样品是否含有钊对gE抗原的抗体取决于每个样品的S,'N值 S'N:等于样品OD值除以 阴性对照01)均值。 2.3.2.1如果样品的S,'N值小于等于。.6，表明血清中含伪狂犬病病毒gE抗体 2.3.2.2 如果S/N位大于。.6、小于等于。.7，应重新检测样品。如仍得到相同的结果，三周后应重新 采样检测。 2.3.2.3 如果S/N位大于0.7,表明血清中无gE抗体。 3 免疫酶组织化学法 3.1 材料准备 3.1.1 试剂 1) 磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章; })) 标准阳性血清:伪狂犬病病毒实验感染猪制备的血清; )， 标准}{fj'性血清:无伪狂犬病病毒感染、未经免疫的猪血清; d) 酶结合物:HRP标记的SPA; 。) 底物溶液 配制