浅析4沉淀法.pptVIP

* * * * 生科 * * * * * * * * * * * * * * * * * * 设计题：胰蛋白酶的提取分离 从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺 胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定 溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI10.8) 浓缩分离胰蛋白酶原（盐析） 溶解激活（酶原-酶） 胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同 * 设计题：胰蛋白酶的提取分离 （二）胰蛋白酶原激活 滤饼溶解, 加入无水CaCl2,边加边搅拌,最终含有0.1M CaCl2； 5MNaOH调pH至8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化8～10小时； 活化完成，用2.5M H2SO4调pH至2.5-3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。 （一）猪胰蛋白酶原的提取 胰脏绞碎加入2倍体积冷乙酸 (pH2.5)低温搅拌24小时，过滤； 滤液用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后，用滤纸过滤； 滤液加入硫酸铵,达0.75饱和度放置过夜抽滤，得酶原粗制品。 （三）胰蛋白酶的分离 将激活溶液加入固体硫酸铵,达0.4饱和度,数小时后抽滤弃滤饼。 滤液加入硫酸铵，饱度达到0.75，放置数小时，抽滤弃滤液，即得胰蛋白酶粗品。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 生技 * * * * * * zhou2 * * （2）pH值：pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 （3）样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以0.5～2％为好，多糖则以1～2％较合适。 （4）中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.01～0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。 （5）某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。 * 举例：固体发酵生产α-淀粉酶的提取工艺研究 α-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液  加乙醇（70%）搅拌 α-淀粉酶↓ * pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 5.5 6.5 pH * 适宜的pH 5.6 ~ 6.0 * 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T℃ * 适宜的温度10 ~ 20 ℃ * 4.6非离子型聚合物 用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋白质。 机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化膜。 常用非离子性聚合物为Polyethylene glycol (PEG)： 是一种水溶性的高分子聚合物，分子量 4,000 以上的 PEG 可以用来沉淀蛋白质。 优点： 1. 室温 2. 颗粒大，易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难去除，幸而 PEG 通常一般不影响下一步的分离。 * 4.7聚电解质沉淀 机理：架桥与静电 离子型多糖聚合物，酸性多糖、羧甲基纤维素、海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。 合成的离子聚合物： 聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀） 聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% 蛋白沉淀） 聚甲基丙烯酸 聚乙烯亚胺 * 4.8 生成盐类复合物沉淀 此类沉析剂有以下三种： （1）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+ 与酸性基团结合； （2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基团结合 （3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等 缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。 * 1.金属离子沉淀蛋白