SDSpage及tricine蛋白电泳.docxVIP

蛋白质电泳 SDS溶液配制Tris缓冲液 （1.5 M， pH 8.8）90.86 g Tris 溶于400 ml 水中，加HCl调pH至8.8，定溶至500 ml。Tris 缓冲液 （1.0 M， pH 6.8）60.57 g Tris 溶于400 ml 水中，加HCl调pH至6.8，定溶至500 ml。30% 丙烯酰胺29 g 丙烯酰胺1 g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于60 ml水（可用37 ℃水浴溶解），定溶至100 ml，过滤后装入棕色瓶，放置4 ℃保存。10% SDS20 g SDS溶于200 ml水。5×Tris 甘氨酸缓冲液15.5 g Tris （1×: 25 mM）94 g 甘氨酸（1×: 250mM）5 g SDS （1×: 0.1%） 或者加50 ml 10% SDS溶液定容至1 L，使用时稀释5倍。5×SDSLoading Buffer 1.25 ml 1M Tris-HCl? pH6.8（终浓度：250 mM）0.5 g SDS （终浓度：10%）25mg 溴酚蓝（终浓度：0.5%）2.5 ml 甘油（终浓度：50%）350 mg 二硫苏糖醇DTT（终浓度约为500 mM） 加入去离子水溶解后定容至5 ml，小份（500 μl）分装，低温保存。5×SDSLoading Buffer0.6 ml 1M Tris-HCl? pH6.8（终浓度：60mM）2 ml10%SDS （终浓度：2%）1ml1%溴酚蓝（终浓度：0.1%）5 ml 50%甘油（终浓度：25%）0.5 ml巯基乙醇（终浓度约为14.4mM） 加入去离子水溶解后定容至10 ml，小份（500 μl）分装，低温保存。2×SDSLoading Buffer 1.25 ml 1MTris-HCl? pH6.80.2 g SDS 0.25 ml 巯基乙醇2.5 ml 甘油0.05 ml 2% 溴酚兰 （溶于乙醇）1.9 ml H2O定容至10 ml，小份（500 μl）分装，低温保存。5×SDSLoading Buffer （非还原）0.4 ml 1.5 M Tris-HCl? pH8.82 ml 10% SDS10 mg 溴酚蓝2.5 ml 甘油5.1 ml H2O定容至10 ml，小份（500 μl）分装，低温保存。染色液 （100 ml）45 ml 甲醇 or 乙醇10 ml 乙酸0.25 g Coomassie Brilliant Blue R-250定容至100 ml。洗脱液30% 甲醇 or 乙醇10% 乙酸制胶配方15%分离胶（10 ml）2.3 ml 水5.0 ml 30% 丙烯酰胺溶液2.5 ml 1.5 M Tris（pH 8.8）0.1 ml 10% SDS0.1 ml 10% APS0.005ml TEMED5% 积层胶（4 ml）2.7 ml 水0.67 ml 30% 丙烯酰胺溶液0.5 ml 1.0 M Tris（pH 6.8）0.04 ml 10% SDS0.04 ml 10% APS0.004 ml TEMED电泳操作制胶：先注入分离胶，预留出分离胶空隙，加水（或异丙醇）将胶面压平。待分离胶凝固后，吸去水（或异丙醇）注入积层胶，放入梳子，待凝固后摘掉梳子。电泳：在电泳槽底部加入缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入缓冲液。上样，加marker。开始电泳。电压80 V。当蓝色染料从积层胶进入分离胶后，电压加到120 V。继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。染色：取出所需胶体，浸泡在考马斯亮蓝染色剂中染色（放置在摇床上）1小时以上回收染色剂，倒入洗脱液退色。Tricine SDS溶液配制正极缓冲液anode buffer（1×）0.2 M Tris (pH 8.9)：12.114 g加H20定容至500 ml, 4 ℃保存。负极缓冲液 cathode buffer（1×）0.1 M Tris + 0.1 M Tricine + 0.1% SDS 不用调pH：6.057 g Tris + 8.96 g Tricine + 0.5 g SDS 加H20定容至500 ml, 4 ℃保存。凝胶缓冲液 gel buffer（G-B, 3×）36.342 g Tris + 0.3 g SDS加H20定容至100 ml, HCl调pH = 8