重组载体pires2-egfp-vegf 的构建及对内皮 - 中国科技论文在线.pdfVIP

中国科技论文在线 重组载体 pIRES -EGFP-VEGF 的构建及对内皮细胞 2 1 的转染 于彩平，王贵学*，唐朝君 生物流变科学与技术教育部重点实验室,重庆大学生物工程学院，重庆 (400044) E-mail:wanggx@ 摘 要：内皮细胞生长因子(VEGF)是一种促进细胞分裂和增殖的糖蛋白，能显著加快内皮 细胞的生长，而绿色荧光蛋白(GFP)作为一种常用的标记分子，能在转染后的细胞中持续表 达并发光。本研究将 VEGF121 基因插入 pIRES2-EGFP 载体中构建重组载体 pIRES2-EGFP- VEGF ，并将重组载体转染到内皮细胞中以观察其对内皮细胞生长的影响。PCR 扩增得到 VEGF121 基因 576 bp 的编码序列，测序验证后插入到携带绿色荧光蛋白基因的真核表达载 体 pIRES2-EGFP 中。将pIRES2-EGFP-VEGF 用 Lipofectamine 2000 对内皮细胞进行转染， 筛选鉴定后表明 GFP 表达，可观察到绿色荧光，抗性筛选后测得细胞生长明显加快。实验 结果表明，重组载体 pIRES2-EGFP- VEGF121 成功转染内皮细胞并加快了内皮细胞的生长 速度。 关键词：内皮细胞；VEGF121；转染 中图分类号：Q291 1 引言 [1] PTCA 术是治疗动脉粥样硬化的技术革命 ，但其术后再狭窄率仍达到 30% 以上，并且 伴随着炎症反应[2] [3] [4] [5-7] ，出血 ，血栓形成 ，内膜增生 等诸多问题的出现。针对这些问题， 各种血管内支架应运而生，而细胞支架因其具有促进再内皮化、减少对内膜的损伤等优点成 为一种新型的血管支架。内皮细胞生长因子(VEGF, endothelial cell growth factor)是一种促进 细胞分裂的糖蛋白，分子量为 34-46 KDa，能促进细胞的迁移、增殖，增强血管的通透性[8] 。 1983 年 D.R. Senger 等[9]首次发现 VEGF 对血管通透性有显著影响，随后有关 VEGF 的研究 越来越多[10-14] 。其中 VEGF121 是 VEGF-A 家族中的一员，具有其他五种转录异构体的全部 生物活性[15] 。本研究将 VEGF 连接到 pIRES -EGFP 真核表达载体中，并对成熟的内皮细 121 2 胞进行转染，评价转染效果，为研究 VEGF121 对细胞支架植入后内皮化速度提供前期研究基 础。 2 材料与方法 2.1 实验材料 质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司。PMD 19-T 载体、PCR相关产 品、限制性内切酶和连接酶购自Takara公司。pCD2.0-VEGF121质粒、pIRES2-EGFP质粒和 人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)为本实验室保存。改良型RPMI 1640培养基购自美国Gibico公 司。优级胎牛血清购自天津TBD灏洋公司。CD31和VEGFR-2抗体购自北京博奥森公司。 Opti-MEM和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。其他常规试剂均为分析纯。 2.2 实验方法 2.2.1 载体构建 1 本研究得到国家自然科学基金项目(项目编号资助 -1- 中国科技论文在线 设计扩增 VEGF121 的特异性引物以pCD2.0-VEGF121 质粒为模板进行扩增。上游引物为 5’ — CCGAATTCA