剖析第三章 蛋白.pptVIP

（2）分子形状和大小不同 凝胶过滤（分子筛）及凝胶电泳、超过滤、密度梯度离心 （3）电离性质不同 等电沉淀、离子交换层析、电泳 （4）生物功能不同 亲和层析 * 三、蛋白质纯度的鉴定 蛋白质制品的纯度鉴定通常采用物理化学方法，如电泳分析、沉降分析、扩散分析、恒溶度法及比活法等。 如果纯化的某种蛋白质，运用不同原理的几种方法进行纯度鉴定而能获得一致的纯度指标，则该纯化蛋白的纯度可以进行结构或功能的研究，或者该蛋白纯品具有很高的价值。 * 第七节 氨基酸的制备、纯化及鉴定* 一、蛋白质的水解 1、酸水解 常用盐酸，一般浓度是6mol/L。 2、碱水解 常用于不能用酸解的方法水解蛋白质制备氨基酸之时。由于水 解产物存在变旋作用，故有较大的局限性。 3、酶水解 常用胰蛋白酶和链霉蛋白酶。依酶的特性进行操作。 * 二、氨基酸的沉淀 蛋白水解液经过滤（或离心）、脱色、再过滤等步骤后，将PH 值调至目的氨基酸的等电点，使其沉淀。 三、离子交换法纯化氨基酸 用于纯化氨基酸的离子交换树脂大多采用交联度为7%的磺酸型 阳离子树脂。由于不同氨基酸的等电点不同，在一定PH的溶液中， 带电基团的性质、大小和数量不同。而氨基酸可与树脂中的离子交 换并结合到树脂上。然后，经洗脱剂的作用，可将结合到树脂上的 氨基酸洗脱下来。 借助于光密度法和分光光度法，分别判断洗脱峰，并测定某种氨基酸的含量。 * 四、氨基酸的鉴定及纯度 氨基酸的定性分析及纯度鉴定可采用氨基酸的双向薄层析法、纸层析法、纸电泳、离子交换层析等方法。 此外，可以采用比色法即通过氨基酸的颜色反应在一定波长范围内测定其光吸收值大小，并计算其含量。 除水解蛋白质这种方法以外，氨基酸还可以发酵法、化学合成法和酶促合成法等生产方法制得。 * 1、 双向薄层析法 基本原理：在玻璃板上以纤维素、硅胶或聚酰胺等涂布成薄层，将所含氨基酸液点样后，经过层析作用得以散开，然后用显色反应找到相应的位置，即可定性鉴定为何种氨基酸。 * 2、 吸附层析 定义：利用吸附剂和抽提液中各种物质之间吸附力强弱的差异而实现分离抽提液中各物质的特性而设计的一种层析方法。 基本原理：蛋白质中的负电荷基团与羟基磷灰石中（蛋白质提纯中，使用得最广和最有效的吸附剂是羟基磷灰石）。的钙离子结合，然后又用磷酸缓冲液将结合其柱上的蛋白质洗脱下来，从而达到纯化蛋白质的目的。 * 2、二级结构存在的形式与特点 多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，蛋白质中的α-螺旋几乎都是右手，右手螺旋比左手螺旋稳定。 相邻的螺圈之间形成链内氢键。 （1） α-螺旋 * 典型的α-螺旋有如下特征： ①每圈螺旋：3.6个a.a残基；高度：0.54nm ②每个残基绕轴旋转100°,沿轴上升0.15nm。 ③氨基酸残基侧链向外。 ④相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。 ⑤肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键。 * （2）β-折叠 两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。 氢键:与肽链的长轴接近垂直。 多肽主链:呈锯齿状折叠构象 侧链R基交替地分布在片层平面的两侧 反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同. 反平β-折叠比平行的更稳定 * （3）β-转角 β-转角又称为β-回折或β-弯曲。 球状蛋白质分子中出现的180°回折，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。 ? β-转角的特征： ①由多肽链上4个连续的氨基酸 残基组成。 ②主链骨架以180°返回折叠。 ③第一个a.a残基的C=O与第四个 a.a残基的N- H生成氢键。 ④C1α与C4α之间距离小于0.7nm。 ⑤多数由亲水氨基酸残基组成。 （4）无规卷曲 没有规律的多肽链主链骨架 构象。往往与生物活性有关 。 * 三、三级结构 1、定义：整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。 * 2、三级结构的一般特征： （１） α