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　　以创新能力培养为重点研究初中生物工程实验设计 第一章前言 基因芯片是指将大量的核酸片段（寡核苷酸/PDN、cDNA、基因组DNA)以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜等载体上组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测杂交信号的强弱进而明确样品中目标分子的数量及组成。由于该技术可以一次高通量快速的对待测样品的基因序列进行检测分析，解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting和Northern Blotting)等技术缺点，诸如检测速度慢、操作过程复杂、一次性可检测序列数量少等。而且，通过不同的探针序列的设计、不同的分析方法使得该技术的应用价值也各有不同，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。自1996年，美国加州Affymetrix公司研制的世界上第1块基因芯片，十几年来，基因芯片技术有了迅猛的发展，芯片包括的基因数不断扩大，目前已广泛应用于动植物和人类基因的研究领域。 其中，基因表达谱芯片技术应用比较广泛，它可以检测完整的基因组巾各个基因mRNA的变化水平，可以对于不同个体、组织、细胞周期及分化阶段的基因其表达情况进行比对研究，从而对相关基因在不同的个体、组织、分化阶段、疾病、刺激的情况下其变化的特征和规律进行探讨研究。众所周知胃癌的发生发展首先是细胞内分子变异，导致其相关基因表达量的变化，进一步产生细胞状态及功能的异常，导致各种各样的临床特征。基因表达谱芯片为研究胃癌MACC1基因提供了理想的技术支持，通过对表达水平差异的MACC1基因的不同细胞株的分析，蹄选出MACC1可能的相关基因，并对其变化特征及其规律进行描述。 胃癌是威胁我国人民健康的常见的恶性肿瘤之一，虽然在北美、欧洲的一些国家近几年胃癌的发病率有所下降，但是在我国，北部及沿海城市的胃癌的发病率及死亡率尤为高，华南地区稍微偏低，根据最新的统计资料，我国城市胃癌的死亡率居恶性肿瘤死亡率的第三位，而在农村，胃癌的死亡率甚至居于第一位。目前手术仍是胃癌的主要治疗手段，同时新辅助化疗、辅助化疗、放疗、生物免疫治疗及中西医结合治疗在胃癌的治疗中都占有举足轻重的地位。虽然近些年在胃癌治疗方面有了较快的发展，然而，其治疗的效果却未见明显提高，死亡率一直居高不下。胃癌预后不佳的主要原因，除了疾病本身及治疗带来的严重的并发症外，胃癌早期转移不易被发现也是重要因素，我国胃癌发现时多已为进展期，早期患者不到10%。胃癌转移主要是通过淋巴结转移、血行转移、种植转移及直接蔓延。如能早期发现胃癌转移，积极予综合治疗，有可能改善其预后。因而，早发现、早诊断、早治疗就成为减少胃癌死亡率的主要措施。我们都知道，肿瘤的发生发展是涉及多个癌相关基因改变的复杂过程，是一个长期的、分阶段的、多种基因突变累积的过程，包括原癌基因的激活与抑癌基因的失活，研究较多的有p53、pl6、p21、APC、p27以及PTEN等，这些基因都与胃癌的发生、发展相关，同时，基质金属蛋白酶、El丐粘素-连环蛋白复合物、血管内皮生长因子及肝脏再生磷酸在胃癌转移方面有了一定的研究，这些都是发现与胃癌转移相关但是尚未有基因能够明确指导临床疗效，所以胃癌转移的分了?标志物还需更深入的研究。 MACC1 (Metastasis-associated in colon cancer 1)基因定位于人染色体7p21.1,又名SH3BP4L，有7个外显了和6个内含子，编码的cDNA包括2559个核苷酸，编码了一个由852个氨基酸残基组成的蛋白。MACC1基因编码蛋白包含四个结构域:ZU5、SH3和两个梭基末端死亡结构域(death domain, DD)。第一个领域属于ZU5家族，该家族通常发现在受体及细胞骨架蛋白巾，大量研究发现，MACC1基因的ZU5结构域可能与红细胞膜内蛋白结合，形成一种新型的蛋白质相互作用界面。ipsaro等人研究发现近细胞膜的共区域化使得ZU5与细胞信号蛋白之间具有高度亲和力。SH3区域属于SH3-2家族，该区域介导蛋白质酷氨酸激酶依赖的信号的转导途径，它参与稳定的蛋白复合物的形成和调节富含脯氨酸的序列结合蛋白的功能。 第二章材料与方法 2.1实验技术路线 1)受体菌的培养：从培养皿上挑取活化后的DH5a菌落，将其接种在5inlLB液体培养基巾，振荡培养12小时后再将50培养液加入5ml LB中，振荡培养1小时，振荡培养均是在37deg;C条件下。 2)感受态细胞的制备：将1.5ml取培养液于离心管巾，置于冰上20min;接着予4deg;C , 5000rprn离心5min，弃其上清液；添加750于己经预冷的CaCl液50mM,用枪轻轻吹打，目的使细胞充分悬浮，冰上预冷30min; 4deg;C，SOOOrpm离心5min，弃其上清液；再加入200nl已预冷的CaC