试验一染色体玻片标本的制作与染色体观察.pptVIP

实验一 染色体玻片标本的制作与染色体观察 辽宁师范大学生命科学学院 张剑锋 一、实验原理 植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间(am9, pm3)，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。 二、实验目的 根尖染色体压片法是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。 三、实验材料 大蒜(Aillum sativum)(2n=16)的鳞基。 四、实验器具和药品 1. 用具：染色板、载玻片、盖玻片、指管、温度计、试剂瓶、滴瓶、镊子、解剖针和毛边纸等。 2. 药品：无水酒精、70％酒精、冰醋酸、对二氯苯或秋水仙素、醋酸钠、碱性品红、石碳酸、甲醛、山梨醇、纤维素酶、果胶酶、中性树胶或油派胶(Euparal)和二甲苯。 卡诺固定液的配制：3 份无水酒精，加1 份冰醋酸(现配现用)。 酶液的配制：以0.1mol/L 醋酸钠为溶剂，配成纤维素酶(2％)和果胶酶(0.5％)的混和液。 染色液的配制：配方Ⅰ：石碳酸品红(Carbol. fuchsin)染色液，先配母液A和B。母液A：称取3克碱性品红，溶解于100毫升的70％酒精中(此液可长期保存)。母液B：取母液A 10毫升，加入90毫升的5％石碳酸水溶液(2周内使用)。石碳酸品红染色液：取母液B 45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37％的甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方Ⅱ，称改良石碳酸品红，可以普遍应用于植物染色体的压片技术。配方Ⅱ：改良石碳酸品红取配方Ⅰ石碳酸品红染色液2-10毫升，加入90-98毫升45％的醋酸和1.8克山梨醇(sorbitol)。此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。 五、实验说明 1. 根尖取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，也可以用茎尖作为材料。 2. 植物细胞分裂周期的长短不同，在十到几十小时之间，温度影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。 3. 前处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理3-4 小时。可处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。 4. 解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。 六、实验步骤 （一）培养及前处理：将大蒜鳞基置于盛水的小烧杯上，放在25℃温箱中，待根长到2cm左右时（见图1-1） ，在上午九时摘下根尖，放到对二氯苯饱或0.02％秋水仙素溶液中，浸泡处理3-4小时。 图1-1 大蒜的培养 （二）固定及保存：经过前处理的根尖，再放到卡诺固定液中固定24小时。固定材料可以转入70％酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。 （三）解离(酸解)：从固定液中取出大蒜根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0.1mol/LHCl中，在60℃水浴中解离8-10分钟，用蒸馏水漂洗后，放在染色板上，加上几滴改良石碳酸品红染色液，根尖着色后即可压片观察。 （四）压片：把染色后的根尖放在清洁的载玻片上，用解剖针把根冠及延长区部分截去，加上少量染色液，并盖上盖玻片。一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相，要达到这个目的，必需掌握以下几点： 1. 压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，细胞和染色体没有伸展的余地。 2. 用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。 （五）封片：把压好的玻片标本，放在干冰或冰箱结冰器里冻结。然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。 七、结果 拍摄并绘制根尖染色体的各分裂相。 图1-2 有丝分裂模式图 图1-3 低倍镜下大蒜根尖细胞有丝分裂各期 图1-4 大蒜根尖细胞有丝分裂后、末期 八、作业 1. 绘制大蒜根尖细胞有丝分裂各时期图象。 2. 说明某一影响制片效果因素的方法、目的和原理。