试验一蛋白质的吸光分析测定.pptVIP

实验一 蛋白质的吸光分析测定 实验目的 通过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、实验步骤 了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法测定蛋白浓度的区别、优缺点以及适用范围。 实验原理 改良Lowry法 在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物。（双缩脲反应 ） 蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。（还原反应） Coomassie亮蓝法 Coomassie亮蓝G250能与蛋白质的疏水区域结合，这种结合具有高度敏感性，G250与蛋白质形成的复合物成蓝色，在595nm处有最大吸收峰，颜色深浅与蛋白质浓度成正比关系，通过建立标准曲线可测定未知蛋白浓度。 紫外分光光度法 有些蛋白质组成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm处有最大吸收峰，故可根据280nm处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量。 在生物样品中还可能会含有核酸等成分，在280nm处也有吸收，它的最大吸收峰在260nm可通过经验公式排除核酸的影响 蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260 实验步骤 改良Lowry法 混匀后置于50度水浴中保温10分钟，冷却 室温放置10分钟 立即混匀，置于50度水浴中保温10分钟，冷却后在650nm处比色 Coomassie亮蓝法 摇匀，室温静置3分钟，以第六管为对照，于595nm波长比色，读取吸光度。 制备标准曲线，根据测定管的OD595nm值计算未知蛋白质浓度 紫外分光光度法 取待测样品稀释液，以蒸馏水为对照，在紫外分光光度计上分别测定OD280nm和OD260nm的吸光度值，根据经验公式计算蛋白浓度 蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260 实验仪器 实验讨论和注意事项 比色法是常用的测定浓度的方法，其关键点在于标准曲线的制备一定要精确。标准样品的配置浓度是否精确直接影响实验的结果，因此要正确掌握加样枪、移液管的操作，保证标准样品配置的准确。 对于分光光度计的使用要正确掌握，注意调节波长。正确的进行仪器的调试和测定，保证结果的准确。 * * 张亚东 谭理 改良lowry法的原理图 650nm 波长 260 280 0.9 - 1.0 未知 测定管 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 试剂A ml 1.0 - 0 6 - 1.0 140 5 - - - - 生理盐水 ml 1.0 1.0 1.0 1.0 标准溶液、样品 ml 105 70 35 17.5 蛋白含量 ug/ml 4 3 2 1 编 号 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 试剂B ml 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 试剂C ml 改良Lowry法蛋白质浓度测定 制备标准曲线，根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度 5 5 5 5 5 5 5 染液 ml 0.1 － － － － － － 样品 ml － － 未知 测定管 0.1 － 0 6 － 0.1 31.25 5 － － － － 生理盐水 ml 0.1 0.1 0.1 0.1 标准溶液 ml 62.5 125 250 500 蛋白质含量ug/ml 4 3 2 1 管 号