番茄 SlPYL-SlPP2C-SlSnRK2 基因家族对ABA 和渗透胁迫的响应及 SlSnRK2s基因的功能研究.docVIP

　　番茄 SlPYL/SlPP2C/SlSnRK2 基因家族对ABA 和渗透胁迫的响应及 SlSnRK2s基因的功能研究 1 绪 论 1.1问题的提出及研究意义 自然条件下，植物受到多种不良环境的影响，比如高温、低温、干旱、高盐、辐射、病害等。其中，干旱和高盐能够引起渗透反应，是逆境胁迫中的重要形式，对农业生产的影响极其严重，同时也是很多地方农业发展的重要制约因素（Longand Ort, 2010）。因此，筛选植物在渗透胁迫应答反应中的重要响应因子，对研究植物的胁迫应答反应通路，提高植物的抗逆性，保障安全生产具有重要的意义。脱落酸（abscisic acid，ABA）是 20 世纪 60 年代发现的一种植物激素，最初因为能促进叶片脱落而得名。然而随着最近几年来的研究发现脱落酸不仅参与种子休眠（Finkelstein, 2002）、果实成熟（Lund et al. , 2008）、影响气孔关闭 (Bartelsand Sunkar, 2005），还参与植物的干旱、盐、病害、高低温等胁迫反应 （Bray, 1988;Zhu, 2002; Reddy et al.，2004; Shinozaki and Yamaguchi, 2006），是植物中一种重要的胁迫激素。研究还发现，在水分胁迫下，ABA 含量上升，促使保卫细胞气孔关闭，调控一些基因的表达，从而减少植物在渗透胁迫下的伤害（Adie et al., 2007）。ABA 信号通路是一个复杂的系统，2009 年以前，人们对它的调控机制和途径不是很清楚，直到两个独立的研究小组发现了 ABA 受体，才使得 ABA 的相关研究取得突破性进展（Ma et al., 2009; Park et al., 2009）。ABA 信号转导途径主要包括３个核心成分：ABA 受体－PYR/PYL/RCAR，负调控因子－2C 类蛋白磷酸酶（PP2C）和正调控因子－SNF1 相关蛋白激酶 2 （SnRK2），它们共同构成一个双重负调控系统 （Umezaura等人（2007）从对ABA超敏感突变体中分离出AtPP2CA。当上述基因的功能一旦缺失，就表现出ABA超敏感性，说明PP2Cs基因在ABA信号通路中起到了负调控的作用（Hirayama and Shinozaki, 2007）。拟南芥中PP2C含有76个基因，可以分为A-J 10个类群，但是只有A类群与ABA信号转导有关。A类群包括了ABI1，ABI2，HAB，AHG 和 PP2CA 类等9个成员（Schura et al., 2007）。这些差异导致了ABI1能调控不同的组织对ABA的响应，而AHG3/AtPP2CA1主要在种子中发挥作用，并在细胞核中调控基因的表达（Leung et al., 1994; Yoshida et al., 2006; Nishimura et al.,2007）。研究发现超表达HAB1能破坏气孔的关闭，抑制ABA诱导基因的表达，植株抗旱性减弱（Alois et al., 2004）。AtPP2C能被干旱、低温、盐诱导表达，抑制表达能增强植株的抗冻性，促进生长（Kuhn et al.,2006; Tahtiharju and Palva, 2001）。在拟南芥中超表达山毛榉的FsPP2C1基因，转基因种子休眠程度降低，对ABA和非生物胁迫敏感性增强，植株出现了矮化和花期延迟的现象（Reyes et al., 2006）。 2 番茄 SlPYL、SlPP2C、SlSnRK2 基因对 ABA 和渗透胁迫的响应 2.1 材料和方法 野生型番茄（Solanum lycopersicum，cv Micro Tom），实验温室内种植，种植条件为光照 16 h，温度 25plusmn;2℃，黑暗 8 h，20plusmn;2℃，湿度为 80%左右。DNA Maker、50 TAE 电泳缓冲液购自 Promega 公司；Trizol 试剂购自 Invitrigen公司；反转录试剂盒购自购自 Fermentas 公司；其他化学试剂（如氯仿、异丙醇、氯化钠等等）购自重庆鼎国公司，定量引物由金思瑞合成，序列如表 2.1。将野生型番茄种子灭菌后播种在 1/2 MS 培养基上，2 周以后挑选生长状态差不多的幼苗移栽到温室，一个月以后做处理。将植株分为 4 组，每组 12-15 颗苗。第一组做对照，采集叶片，用液氮速冻，保存于-80℃。第二组用 100 mu;M ABA 处理，第三组用 150 mM 的 NaCl 处理，于 24 h、72 h 采集样本。第四组连续两周不浇水直到萎蔫，收集叶片，保存同前。将得到的RNA稀释50倍后，测RNA纯度，即OD260/OD280 值，比值在1.8-2.0的保存备用。取 1 mu;L RNA 凝胶电泳进一步