富硒锌纳豆芽抱杆菌的选育具体方法及实验室设计.docxVIP

富硒、锌纳豆芽抱杆菌的选育具体方法及实验室设计纳豆是由纳豆芽抱杆菌发酵大豆而成的健康食品。纳豆中含有丰富的营养物质,尤其是因含有具有溶栓功效的纳豆激酶而越来越受到人们的关注。硒具有抗氧化、抗癌、抗炎、增强免疫等生理作用。在生物体内,具有生物学意义的硒为有机硒化合物,硒主要参与生物体内一些氨基酸和酶的组成。微生物、植物和动物都可以将无机硒转化为不同分子形态的甲基化产物。人体对低分子量的有机硒较易吸收。营养学和流行病学认为,成人每天硒的摄取量约在40--100g。缺硒与肿瘤、高血压、克山病和大骨节病的发生有密切关系。锌是人体组织中重要的微量元素。锌在组织中参与构成大约80多种金属酶,这些酶参与人体骨骼发育、组织代谢、红细胞生成及胰岛素、雄性激素、前列腺素的合成;对儿童、青少年的生长发育有着非常重要的作用。人体缺锌可导致厌食、生长停滞、上皮细胞增厚和角化、成骨障碍及血浆及骨内碱性磷酸酶减少。硒和锌是人体必须的微量元素,对人体健康具有非常重要的作用。由于无机硒、锌不易被人体吸收,且过量容易中毒。因此,利用纳豆芽抱杆菌将无机硒、锌生物转化为有机硒、锌后,进行富硒、锌纳豆的发酵,既有助于人体对硒、锌的摄取,也提高了纳豆的营养价值。选育方法1.1材料与方法1.1.1菌种与培养基菌种:纳豆芽抱杆菌为实验室保存菌种。液体培养基:牛肉膏5g ,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸馏水1000ml,pH值7.0---7.2。固体培养基:在液体培养基的基础上添加15----20g琼脂。1.1.2试剂纤维蛋白原,购自Sigma公司;凝血酶,购自中国药品生物制品鉴定所;七水合硫酸锌、亚硒酸钠(分析纯),均购自天津化学试剂三厂。1.1.3仪器UV一754型紫外分光光度计,上海市分析仪器总厂;手提式高压灭菌锅,山东新华医疗器械厂;JG-IA型高压细胞破碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司。1.2实验方法1.2.1纳豆芽抱杆菌最大无机硒、锌转化浓度的确定配制含不同浓度无机硒、锌的固体LB培养基,接种纳豆芽苞杆菌,37℃培养24h,观察不同硒、锌浓度下的纳豆芽抱杆菌生长情况(菌落形态),确定最大无机硒、锌的转化浓度。1.2.2纳豆芽抱杆菌液体培养无机硒、锌添加量的确定液体培养基中添加五水合亚硒酸钠或七水合硫酸锌,浓度分别为10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L,活化的菌种按3%的接种量接种培养基中,于37℃培养19h。①420nm波长下,测定OD值。②菌悬液6000r/min离心15min,弃上清,称量湿重。③菌落计数。1.2.3纳豆芽抱杆菌菌体内硒、锌含量的测定将培养后的菌液低温离心,收集菌体,破碎,pH7.4磷酸缓冲液充分透析,低温离心,得到的沉淀真空冷冻干燥至恒重，检测有机硒、锌含量。1.2.4富硒、锌纳豆芽抱杆菌发酵条件的优化以纳豆激酶的酶活作为标准优化富硒、锌纳豆的发酵条件。影响富硒、锌纳豆发酵的因素有发酵温度、发酵时间、硒浓度、锌浓度及接种量,根据此五因素设计正交试验 ,优化富硒、锌纳豆的发酵条件。1.2.5最佳发酵条件下纳豆芽抱杆菌菌体有机硒、锌的含量测定利用优化所得的最佳发酵条件下进行富硒、锌纳豆发酵,收集菌体,破碎,透析,干燥, 测定有机硒、锌的含量。实验证明,富硒、锌纳豆的最佳发酵条件为:每kg大豆中添加无机硒10-6mol;锌10-6mol;接种量7%;温度42℃ ;培养时间19h。富硒、锌纳豆中 ,纳豆激酶酶活为1195.96IU/g ,纳豆芽抱杆菌活菌数为4.5x109个/g。每kg纳豆中有机硒、锌的含量分别为6.58μmol和7.39μmol , 其转化率分别为65.8%和73.8%。实验室设计房间用途及设计思路1.办公室供工作人员办公休。2.培养基制作室培养基室是制作、配制微生物培养所需的培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为操作台与药品柜。操作台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用；还要放天平，以称取药品用；操作台材料要耐高热、耐酸碱；药品柜分门别类存放一些一般药品及试剂。3.菌种培养室培养基室是制作、配制微生物培养所需的培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为操作台与药品柜。操作台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用；还要放天平，以称取药品用；操作台材料要耐高热、耐酸碱；药品柜分门别类存放一些一般药品及试剂。4.实验室理化分析室是物理化学分析的主要操作室。实验台与细菌操作室要求相同，设置通风橱以满足加热、消化、干燥、烧灼和化学处理等工作需要。发酵工厂菌种实验室的设计对防止污染杂菌相当重视，因此在结构和布局上精心设计，合理安排。在仪器设备的选择和布置上本着既要满足工作要求，又要便于操作的原则。从先进性、适用性和经济性等方面统筹考虑，进而构建了菌种实验室的平面图5.洗涤室洗涤室用以消毒洗涤待用与已用之玻璃器皿，培养