第四章 克隆载体特征和类型.pptVIP

第四章 基因克隆的载体;;第一节 载体的功能及特征;载体应具备的条件;自主复制型载体和附加载体的扩增方式 ;载体的类型;克隆载体(cloning vector) ;穿梭载体(shuttle vector) ;第二节 质粒;天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。? ;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。;质粒; 利用抗性基因进行重组子的筛选;质粒基因编码的特性;天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-30/cell pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell，标记基因为Tcr;理想的质粒载体应具备的条件;　　天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件　　 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。;质粒;质粒;优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。;;质粒;pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。;质粒;魁颈靡扰窑凿鸥没擞粥矫船盛篡遥炭昔溶跌拢蜘烩触碑七澄怕扦臃耐笼硼第四章 克隆载体特征和类型第四章 克隆载体特征和类型;质粒;在重组的pGEM3Z载体中加入相应的RNA聚合酶，可以发生外源基因转录。;质粒载体总体评价;第二节 噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;l 噬菌体生物学特性： 生物结构;噬菌体或病毒DNA;;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;第三节 考斯质粒;将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。 ;考斯质粒（cosmid）;考斯质粒（cosmid）;人造染色体载体;人造染色体载体;人造染色体载体;人造染色体载体