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冠瘿病菌检疫技术操作办法 字体：大 中 小??2009-9-1??来源：省林检局??阅读： 134 次??[关 闭] 1 1.1 本办法规定了冠瘿病菌Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend) Conn的检疫检验及检疫处理操作办法。 1.2 本办法适用于林业植物检疫机构对杨属Populus spp.、柳属Salix spp.、苹果属Malus spp.、梨属Pyrus spp.、蔷薇属Rosa spp.、山楂属Crataegus spp.、李属Prunus spp.、栗属Castanea spp.、葡萄属Vitis spp.等林木、果树和木本花卉植物活体、残体的检疫检验和检疫处理。 2 产地检疫 2.1 种苗繁育基地的建立 2.1.1 应选用无疫情的繁殖材料。 2.1.2 有疫情发生的地块，3年内不再繁育其寄主植物。 2.2 踏查 2.2.1 在种苗繁育基地、林地、果园和木本花卉栽植地，以自然界线、道路为单位进行线路（目测）踏查。 2.2.2 调查罹病植株是否表现矮化、干枯，叶片是否黄化、早落，根系是否细小、须根少。 2.2.3 调查中、幼龄植株的根冠部是否有灰白色、球形或扁球形的光滑软质瘤，是否有褐色、深褐色、表面粗糙龟裂、周围和表面生有细根的木瘤；根茎和主干上是否有表面粗糙、龟裂、质地坚硬的木瘤。 2.2.4 确认有疫情需进一步掌握危害情况的，应设标准地（或样方）做详细调查。 2.3 标准地（或样方）调查 2.3.1 种苗繁育基地样方设置与调查 2.3.1.1 样方的累积面积应不少于调查总面积的5%。 2.3.1.2 每块样方面积为10 m2，在样方内按“Z”形线路取样，抽取样株不得少于20株。 2.3.2 林分标准地设置与调查 2.3.2.1 按林分面积设置，10 hm2以下（含10 hm2）设1块，10 hm2以上按总面积的2%设置。 2.3.2.2 每块标准地面积为0.1 hm2，在标准地内随机抽取20–30株进行调查。 2.4 病害分级标准 轻 被害株率 5%以下； 中 被害株率 6%–15%； 重 被害株率16%以上。 3 调运检疫 3.1 抽样比例 3.1.1 苗木按一批货物总件数（株）的5%抽取，少于5件或50株的应全部进行调查。 3.1.2 疫情严重的，需扩大抽样数量，至少应扩大到该批货物总件数（株）的10%。 3.2 抽样方法 3.2.1 苗木按照抽样比例，采取分层方式设5个样点进行抽样。 3.2.2 将抽取的样品放在100 cm(100 cm的白布（或塑料布）上，逐株进行检查。 3.3 现场检验 3.3.1 检查寄主植物的根冠部是否有瘤状突起，是否有带细根的木瘤，是否有大小不一、形状不同或互相连结的瘤。 3.3.2 检查寄主植物的根茎和主干上是否有表面粗糙、龟裂、质地坚硬的木瘤。 4 检疫检验 4.1 分离培养检验 4.1.1 取新鲜幼嫩根瘤，用解剖刀切成约2 mm×2 mm的小块，置于灭菌培养皿内，放入灭菌水清洗并去除陈腐组织和杂质。 4.1.2 将洗净的材料在70%酒精里蘸5 s，在酒精灯火焰中来回3次后，放入灭菌水里清洗3次。 4.1.3 将经过上述处理的材料放入研钵内，加入适量灭菌水研碎后静置10 min。 4.1.4 用接种环蘸取上述分离材料的组织液，接种在YEM培养基上划线分离。检查培养基上是否形成有光泽、隆起、边缘完整、半透明、呈灰白色至淡灰棕色的粘稠圆形菌落。 4.2 形态与染色检验 4.2.1 形态观察 4.2.1.1 将分离到的细菌在YEM培养基上培养24–48 h，用移菌环挑取少许菌苔放入无菌水试管中配成108 CFU/ml菌悬液，取菌液滴在载玻片上，立即将载玻片倾斜，使菌液迅速流成菌液膜，风干并通过火焰2–3次使菌体固定。 4.2.1.2 用酸性苯酚品红染色1 min，用清水冲去染液，待干燥后用油镜观察菌体形态（杆状）。 4.2.2 革兰氏染色 采用结晶紫草酸胺染色法。经固定涂片→染色1 min→水洗数秒吸干→碘液处理1 min→水洗数秒吸干→褪色30 s→水洗数秒吸干→复染10 s→水洗吸干后镜检。 土壤杆菌属为革兰氏阴性，呈红色。 4.2.3 鞭毛染色 采用西萨—基尔（Cesares-Gill）染色法。经染媒剂5–7 min处理→水洗干燥→苯酚品红染色5 min→水洗干燥后镜检。 土壤杆菌属镜检菌体和鞭毛为阴性反应，呈红色，鞭毛1–6根。 4.3 生理生化检验 4.3.1 生长与温度试验 生物变种1可以在35 ℃生长，生物变种2和生物变种3则不能生长。 4.3.2 耐盐性试验 生物变种1