h9n2亚型禽流感病毒在mdck细胞中增殖最佳条件研究.pdf

H9N2亚型禽流感病毒在 MDCK细胞 中增殖最佳条件研究 史爱华，张建伟 ，沈 佳，姜北宇，章振华，李 林，景小冬 (北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097) 摘 要：为了探讨 H9N2亚型禽流感病毒在 MDCK细胞 中增殖的最佳条件 ，将不同毒株、不 同接种量 的H9N2亚型禽流感病毒接种MDCK细胞单层 ，接毒后直接加入或吸附1h后加入含有 10ug／mL胰蛋 白 酶的DMEM 维持液 ，每隔24h观察细胞病变，并测定细胞上清液中HA滴度 。结果表明，分离株 HN04在 MDCK细胞中增殖能力较其他 2株强，接种后 72h可达到 6log2；病毒接种细胞的最佳稀释度为1O～1O 之间；病毒接种细胞后吸附与否对病毒滴度无显著差异。 关键词：禽流感病毒；H9N2亚型；MDCK细胞；增殖 中图分类号 ：$852．659．5 文献标识码 ：A 文章编号：1007—5038(2011)1i-0042—04 禽流感病毒 (Avianinfluenzavirus，AIV)是严 1 材料与方法 重危害家禽和野禽的一种烈性传染性病原，其 中 1．1 材料 H9N2亚型低致病力禽流感 (LPAI)病毒虽致病力 1．1．1 毒株 禽流感病毒H9N2亚型地方分离毒 较低 ，但依然是威胁我 国养禽业 的最重要疫病之 株 ：A／Chicken／Hebei／WD／98(H9N2)株 (简 称 [¨ 一 。 姜北宇等 。对禽流感 H9亚型流行毒株进行 WD98株)，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免 了交叉保护试验。近几年来 H9N2亚型禽流感在免 疫预防研究室 1998年从河北省望都分离 ；A／Chick— 疫鸡群中时有发生[3]，严重制约着我 国养禽业 的发 en／Henan／QX／04(H9N2)株 (简称 HN04株)，由河 展 。叶柱德等[4对 HgN2禽流感疫苗的研究进行了 综述 。常规的禽流感疫苗生产过程 中，鸡胚是禽流 南农业大学王泽霖教授惠赠；A／Chicken／Hebei／ 感病毒最为常用的一种培养基质，但用鸡胚尿囊液 ZD／O4(H9N2)株 (简称 ZD04株)，由北京市农林科 制备抗原过程 中禽流感病毒易引起抗原性变异 ；大 学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室 2004年从河 规模生产时还存在鸡胚数量不足和潜在外源病毒污 北省正定分离。 染 的问题[5]。以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有 1．1．2 细胞 MDCK细胞购 自中国兽医药品监察 无外源因子污染 、易于规模化生产、可以较好的维持 所 ，在北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防 病毒抗原稳定等优点。许多学者L6 利用 MDCK 研究室传代培养至 77代 。 细胞制备人流感疫苗做 了大量研究，制备的疫苗可 1．1．3 细胞培养液 生长液为含 100mL／L胎牛 产生与鸡胚苗同样的免疫效果。在利用生物反应器 血清和 100单位 ／mL青霉素一链霉素的DMEM；维 进行病毒增殖时，不同病毒株、病毒接种剂量均非常 持液为含 10~／g／mL胰蛋 白酶的DMEM。 重要，而且无法进行病毒接种后的预吸附过程。本 1．1．4 鸡红细胞悬液 10mL／L鸡红细胞悬液由 研究通过对不 同病毒株 、不同接种剂量 以及病毒与 北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研