实验13-设计性实验---产抗霉菌活性产物的拮抗菌的分离筛选及初步鉴定.doc

微生物学设计性实验（10-11-1） 一、题 目：产抗霉菌活性产物的拮抗菌的分离、筛选及初步鉴定 二、分 组：每4人一组 四、目的要求： 1、通过巩固微生物学的基础理论知识； 2、巩固学生微生物学实验操作技能，为后续课程的实验操作奠定坚实的基础； 3、培养学生的创新意识与协作精神； 4、培养学生的独立工作能力，分析问题与解决问题的能力。 四、研究背景 新鲜的水果在采摘、运销、以及贮藏过程中因病害腐烂而导致巨大的经济损失。水果采后贮运防腐是水果生产健康发展中必不可少的重要环节。据统计,在发达国家每年有10%～30%40%～50%20%～50%Captan)和苯菌灵(Benomyl)等被美国环保机构所禁用,并部分或全部地自动退出采后果蔬防腐保鲜的应用市场。此外,大量长期使用单一种类的杀菌剂会使病原菌产生抗药性问题,使杀菌剂的效果大大降低,且严重污染环境,有损于人类健康,已为世人普遍关注,特别是采后果蔬贮运过程中环境温度低、末受日晒雨淋,化学杀菌剂极难分解,公害问题尤为突出。 因此迫切需要寻找一种有效而对人类无害的防治方法。以微生物的提取物用于水果采后防腐保鲜己显示出巨大的应用前景,并成为一个新的研究热点。天然防腐保鲜剂取代化学杀菌剂进行水果采后病害的防治,对减少食品中农药的残留、保护环境、保证食品安全等具有重要意义。 无化学制剂污染的绿色、有机果品深受消费者的青睐,而且销售价格成倍高于普通食品,而且无化学制剂污染的绿色食品、有机食品也是规避境外贸易壁垒,优质水果顺利进行国际市场的有效途径。上世纪中后期以来国内外诸多学者就果、蔬采后的非化学杀菌剂防腐进行了大量的试验,迄今为止却仍未获得重大进展,化学杀菌剂防腐仍是水果采后防腐的主要途径。 微生物的代谢产物是源于天然的物质,容易被分解,杀菌活性物质用于水果的采后防腐不会造成累积慢性中毒,亦不会造成果品与环境污染,开发适用于水果采后贮藏防腐的微生物杀菌活性物质不仅符合当今社会发展的需要,而且产品具有极大的国内外市场需求量。 生物防治,国内外近年来发展起来的一个新研究领域和研究热点,是当今世界公认的避免化学杀菌剂污染的有效途径,且每年都有不少的研究报道。目前生物防治的研究内容主要包括以下三方面:（1）选用有拮抗作用的微生物抑制病原微生物,实质就是利用生物种间关系、种内关系调节有害生物种群密度,即用生物群去防治生物群；（2）利用微生物、植物或动物产生的天然活性抗病物质,以及植物产生的一些油和挥发性物质来抑制采后病害；（3）通过诱导寄主的抗性达到抑制病害的目的。 随着科技的不断进步和人类环保意识的增强,生物防治菌及生物抑菌活性物质、生物防腐剂的研究和开发已越来越受到人们的重视,并逐渐被认为是解决上述问题的一种有效的途径。 拮抗微生物是生长中能产生对其它微生物具杀死与生长具有抑制作用的生物活性物质微生物，如产黄青霉产生青霉素等，现在世界已公开发表的微生物来源的生物活性物质数量已超过15000种，在应用于临床的大部分微生物药物中,大多数都是放线菌的次级代谢产物, 放线菌产生的抗菌活性物如β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、糖肽类、多烯类等。 土壤中菌种资源丰富,拮抗菌广泛存在,而且培养方便,最近十年,利用生防活性放线菌的产生的活性物质已成为无公害农药发展的主体,世界各国对放线菌的研究与资源开发都极为重视,已有许多制剂应用于实际生产,主要有：(1)井岗霉素,北方是防治小麦纹枯病的主要农药；(2)多效霉素，对苹果树腐烂病菌、苹果果实腐烂病菌、葡萄白腐病菌等具有较强的抑菌作用；(3)梧宁霉素,据试验,其发酵液对苹果树腐烂病菌孢子的萌发,菌丝的生长及大田病斑的扩展具有强烈的抑制作用；(4)S-921菌株及其发酵液对苹果树腐烂病具有强烈的抑制作用,且对病原菌具有溶菌作用；(5)农抗120，近年来曾得到广泛应用,用于防治小麦白粉病、水稻纹枯病、苹果树腐烂病、花生叶斑病、西瓜枯萎病等。 本课题的产品为微生物次级代谢产物,用于水果采后防腐果实处理后的药液,即使倾倒于自然环境中也易于被微生物分解利用,不至造成土壤及水域污染；此外,使用本课题产品进行水果的采后防腐就减少了化学杀菌剂在生产上的应用,就相应减少化学杀菌剂的生产量,从而减少了化学农药生产过程中对生态环境的破坏作用。 五、主要步骤： （一）采集土样 从森林表层土壤，或菜地、果园或种粮食作物土5-20cm内的土壤取土样，每块地取5个点，每点取土约100g，共500g土混装在一起。取土时记录采样时间、地点、地面植物种类。 要求必须从校园外取土，每组取样的土样必须不同植物的土壤中取3个以上，分别进行目的微生物的分离。 （二）拮抗微生物的分离 1、准备工作 制备培养基：PDA培养基、高氏一号培养基(制平板时可加青霉素、放线菌酮)、牛肉