实验一 ELISA.pptVIP

免疫学实验 预防兽医学系助教 杜崇涛 Contents 酶联免疫吸附实验 一、目的要求 二、教学内容 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理。了解熟悉其他常用免疫标记技术，熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法。  三、实验原理 近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。 由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA）. 三、实验原理 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。 三、实验原理 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 三、实验原理 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 三、实验原理 ELISA常用的几种方法?? ? (一)测定抗原的，主要有四种方法 1.竞争法 2.双抗体夹心法 3.改良的双抗体夹心法 4.抑制性测定法。 (二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也 是目前最常用的方法. 四、实验步骤 四、实验步骤 结果判定： 1、临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值N×2.1。 2、阴性对照孔OD均值大于0.1时重新实验，小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样品OD值S/ C.O.≥1者为阳性， 样品OD值S/ C.O.＜1者为阴性。 五、注意事项 1、加试剂前应混匀，力求滴加准确。 2、所有样品按传染源处理。 3、洗涤时各孔均需加满。 六、ELISA的应用 ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关 。 六、ELISA的应用 (一):检查抗原和半抗原方面 1.内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，其敏感性与RIA相当 2.在血液学方面可用于检查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等 3.在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），对前者的敏感性已达到与放射免疫试验相当的水平，但对CEA检查的敏感性较低，目前尚不能用于常规诊断 六、ELISA的应用 4.在传染病的诊断方面正在日益扩大，其中最满意的是用于检查乙型肝炎表面抗原 5.在免疫化学方面可用于检测白蛋白，免疫球蛋白的各种组份，也可用于