质粒电穿孔转染条件选择.pdfVIP

No．6P．858 第38卷第6期第858页 华中科技大学学报(医学版) V01．38 2009年12月 ActaMedUnivSciTechnol Dec． 2009 Huazhong ，+。+。+。+。+、 i技术交流i ＼．．…．．．．．／． 质粒电穿孔转染条件的选择* 杨 薇1。 王 迪-。 陈克清1 于 敏1 王桂华2 胡俊波2△ 王 晶1△ 1华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系。武汉430030 2华中科技大学同济医学院附属同济医院分子医学中一O，武汉430030 关键词电穿孔转染；质粒 中图法分类号R331DOI：10．3870／j．issn．1672-0741．2009．06．037 电穿孑L转染，作为物理方法的一种，出现于20 在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定 世纪80年代中期[1]。这种方法不仅能够将DNA、值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。 000 RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细 对于动物细胞来说，电场强度通常选择1～1 菌、酵母、动物细胞和植物细胞。它是一种高效、简 V／cm，并遵循低电场长时程的原则。电场强度的大 便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的 小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec 优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，’ 适用谱广等。尤其对目前一般认为难转染的悬浮培 DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大； 养细胞[2]，亦能获得较高的转染率。本文将简述电 高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小 穿孔转染方法的基本原理和过程，并从电参数、细胞 无关。电场强度的大小对细胞存活率的影响主要 因素、质粒因素、温度、缓冲液以及培养液成分等方 有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强 面介绍质粒电穿孑L转染条件的研究进展。 下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存 活率在高场强下降为0。因此，要保证较高的转染效 1 电穿孔转染的基本原理及过程 率，必须综合考虑DNA摄入量以及存活率两个方 电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫 面。不同的细胞系具有不同的最佳场强值，其确定 秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子 方式除了实验直接测定比较不同场强下(对悬浮细 如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。其过 胞来说，取1～3倍的阈电场强度，对贴壁细胞来说 程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿 可升至5倍)转染率的高低之外，还可以采取较为简 孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞 便的间接法[5]。文献显示存活率在50％左右的电 膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。再次 场参数为较理想的参数，故可间接测定存活率来确 电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬 定最佳场强值。 转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳 2．2脉冲时程 转。一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可 时间常数为电容与电阻的乘积，是设定的电压 自动重新闭合Is-4]。 呈指数衰减到37％的时间。电脉冲的时间长短对 电转